عالية الإنتاجية<em> دانيو Rerio</em> طاقة الإنفاق الفحص
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
الزرد هي كائن نموذجا هاما مع المزايا الكامنة التي لديها القدرة على جعل الزرد نموذجا يطبق على نطاق واسع لدراسة توازن الطاقة والسمنة. صغر حجم الزرد يسمح لفحوصات على الأجنة التي ستجري في شكل لوحة 96- أو 384-جيدا والتكنولوجيات Morpholino وكريسبر أساس تعزيز سهولة التلاعب الجيني، والعلاج من تعاطي المخدرات من خلال تطبيق الحمام غير قابلة للحياة. وعلاوة على ذلك، الزرد مثالية لشاشات الوراثية إلى الأمام السماح لاكتشاف الجين الرواية. نظرا لحداثة النسبية للالزرد كنموذج للسمنة، فمن الضروري لتطوير الأدوات التي تستغل بشكل كامل هذه الفوائد. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استهلاك الطاقة في الآلاف من الزرد الجنينية في وقت واحد. قمنا بتطوير كامل منصة صفيحة ميكروسكوبية الحيوانات التي نستخدمها لوحات 96-جيدا لعزل الأسماك الفردية ونقيم التراكمي إنتاج NADH 2 باستخدام المتاحة تجاريا زراعة الخلايا جدوى إعادةوكيل alamarBlue. في متغيرات الحرارة ترتبط بإحكام العلاقة بين NADH 2 إنتاج واستهلاك الطاقة. هذا الاختبار نفقات الطاقة يخلق القدرة على الشاشة بسرعة التلاعب الدوائية أو الوراثية التي تغير مباشرة نفقات الطاقة أو تغيير الاستجابة لدواء التطبيقية (على سبيل المثال محسسات الأنسولين).
Introduction
الفأر هو حاليا النموذج السائد للأبحاث السمنة. كانت فترة جيل قصيرة والأدوات الجينية المتاحة في الماوس لا مثيل لها حتى الآن. ومع ذلك، فقد الزرد أيضا فاصل الجيل قصيرة (3-4 أشهر)، ويفوق حتى الماوس في سهولة التلاعب الجيني 1،2. يحافظ على الزرد ما يقرب من 90٪ من الجينات الثدييات، في حين يتجاوز بكثير الماوس في عدد من ذرية والإمكانات للاستخدام في شاشات الوراثية والمخدرات 3.
للاستفادة من إمكانات من طراز الزرد للدراسات في السمنة، ويجب وضع المقايسات للتحقيق في العوامل التي تؤثر على تنظيم وزن الجسم، بما في ذلك نفقات الطاقة. كما تتم معالجة الأيض من خلال β للأكسدة وحمض الكربوكسيليك دورة الأكسجين ويستهلك وينتج NADH 2. وهكذا، NADH 2 هو مؤشر مباشر على تدفق الأيض من خلال المسارات الأيضية (التمثيل الأيضي الأكسدة). في poikilotherms، H + تسرب من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلية، التي uncouples NADH 2 الأكسدة من ATP التوليف، هو 4-5 أضعاف أقل مما كانت عليه في متجانسات الحرارة 4. وفقا لذلك، في NADH الزرد 2 يرتبط بإحكام جدا لإنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. هنا، نحن تصف مقايسة الذي يقيس NADH 2 الإنتاج في الزرد اليرقات كوكيل للإنفاق الطاقة 5.
استهلاك الأوكسجين هو المعيار الذهبي لقياس استهلاك الطاقة. ومع ذلك، وإلى الاستفادة القصوى من إمكانيات إنتاجية عالية من الزرد، ويجب أن تكون المقايسات من نفقات الطاقة قابلة للالإنتاجية العالية. نظم استهلاك الأوكسجين التي تعتمد على غرفة مغلقة تعميم نظام محدودة في الإنتاجية من قبل عدد من الغرف المتاحة 6. فتح O الهواء 2 استهلاك / CO 2 فحوصات الإنتاج كما تم تطبيقه في الزرد 5،7. هذه 96-جيدا في الهواء الطلق لوحة قاعدةنظم د قابلة للإنتاجية عالية. للأسف، تبادل الغازات مع البيئة يحد حساسية هذه المقايسات. نشرنا مؤخرا تطبيق مقايسة التي تراقب NADH 2 باستخدام مؤشر الأكسدة alamarBlue 5. هذا الاختبار يتغلب على القيود في سرعة وحساسية مشتركة لتحليل استهلاك الأوكسجين في الزرد.
الزرد أصبحت نموذجا متزايد الأهمية للدراسات كله توازن الطاقة في الجسم. في جزء منه، لأن الزرد هي قابلة للاستخدام في شاشات الوراثية إلى الأمام وشاشات المخدرات. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب الجيني، بما في ذلك ضربة قاضية واضعا في، ويمكن تطبيقها بسرعة. لقد أظهرنا سابقا أن هذا الاختبار يمكن دمجه مع تطبيق حمام المخدرات وضربة قاضية وراثية أو خروج المغلوب لتحديد المركبات والجينات التي تغير معدل الأيض 5. وعلاوة على ذلك، تم تصميم هذا الاختبار لاستغلال مزايا الإنتاجية العالية المتأصلة في الزرد. </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
سوف التلوث بالبكتيريا أو الفطريات يحد بشكل كبير من تطبيق هذا الاختبار. الأزرق الميثيلين في المتوسط الجنين E3 يحد من إمكانية التلوث الفطري. في جميع أنحاء الجنين تربية فمن الأهمية بمكان أن الرعاية التي اتخذت لإزالة الأجنة الميتة مرتين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، فمن ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
Referências
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A practical approach. , (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
