High Throughput<em> Danio rerio</em> Energia Despesas Assay
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Peixe-zebra são um modelo importante organismo com vantagens inerentes que têm o potencial para fazer zebrafish um modelo amplamente aplicado para o estudo da homeostase da energia e da obesidade. O pequeno tamanho do peixe-zebra permite ensaios sobre os embriões para ser conduzido num formato de placa de 96 ou 384 poços, morfolino e tecnologias baseadas CRISPR promover a facilidade de manipulação genética, e no tratamento de droga por aplicação de banho é viável. Além disso, peixe-zebra são ideais para telas genéticos para a frente, permitindo a descoberta do gene para a novela. Dada a relativa novidade do peixe-zebra como um modelo para a obesidade, é necessário desenvolver ferramentas que exploram plenamente esses benefícios. Aqui, nós descrevemos um método para medir o gasto de energia em milhares de peixes-zebra embrionária simultaneamente. Nós desenvolvemos uma plataforma de microplacas animal completo no qual usamos placas de 96 poços para isolar cada peixe e avaliar cumulativa de produção de NADH usando a 2 disponível comercialmente cultura celular viabilidade reagente alamarBlue. Em poiquilotérmicos a relação entre NADH 2 produção e gasto de energia está intimamente ligado. Este ensaio gasto energético cria o potencial para a tela rapidamente manipulações farmacológicas ou genéticas que alteram diretamente o gasto de energia ou alteram a resposta a um fármaco aplicada (por exemplo, sensibilizadores de insulina).
Introduction
O mouse é atualmente o modelo predominante para a investigação de obesidade. O curto intervalo de geração e ferramentas genéticas disponíveis no rato têm sido inigualável até à data. No entanto, o peixe-zebra também tem um intervalo de geração curto (3 – 4 meses) e supera até mesmo o mouse na facilidade de manipulação genética 1,2. O peixe-zebra mantém quase 90% de genes de mamíferos, enquanto ultrapassando o mouse no número de descendentes e potencial para uso em telas genéticos e medicamentos 3.
Para explorar o potencial do modelo peixe-zebra para estudos em obesidade, os ensaios devem ser desenvolvidos para investigar os fatores que influenciam a regulação do peso corporal, incluindo as despesas de energia. Como metabolitos são processados através β-oxidação e o ácido tricarboxílico ciclo oxigénio é consumido NADH e 2 é produzido. Assim, NADH 2 é um indicador directo do fluxo de metabolitos através de vias metabólicas (oxidação metabolito). Em poikilotherms, H + vazar através da membrana mitocondrial interna, que desacopla o NADH 2 de oxidação a partir da síntese de ATP, é de 4 – 5 vezes menor do que em homeotérmicos 4. Assim, em NADH 2 peixe-zebra é muito bem ligados à produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Aqui, descrevemos um ensaio que mede a produção de NADH 2 em zebrafish larval como um proxy para o gasto energético 5.
O consumo de oxigênio é o padrão ouro para medir o gasto de energia. No entanto, para melhor aproveitar o potencial de alto rendimento do peixe-zebra, ensaios de gasto de energia devem ser passíveis de high-throughput. Sistemas de consumo de oxigênio que dependem de uma câmara fechada, sistema de circulação são limitados em taxa de transferência pelo número de câmaras disponíveis 6. Open air consumo de O 2 / CO 2 ensaios de produção também foram aplicadas no peixe-zebra 5,7. Estes ar livre de 96 poços placa de baseD Systems são passíveis de alto rendimento. Infelizmente, as trocas gasosas com o ambiente de limites de sensibilidade destes ensaios. Nós publicada recentemente a aplicação de um ensaio que monitora NADH 2, utilizando o indicador redox alamarBlue 5. Este ensaio supera as limitações na taxa de transferência e sensibilidade comum às análises de consumo de oxigênio no peixe-zebra.
O peixe-zebra está se tornando um modelo cada vez mais importante para estudos da homeostase energética do corpo inteiro. Em parte, por causa do peixe-zebra são passíveis de uso em telas genéticos para a frente e telas de drogas. Além disso, orientada manipulação genética, incluindo knockdown e knock-in, pode ser aplicada rapidamente. Nós mostramos anteriormente que este ensaio pode ser combinado com a aplicação de drogas e banho de knockdown ou nocaute genético para identificar compostos e genes que alteram a taxa metabólica 5. Além disso, este ensaio foi concebido para explorar as vantagens de elevada capacidade inerentes ao peixe-zebra. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
A contaminação com bactérias ou fungos limita grandemente a aplicação deste ensaio. O azul de metileno no meio embrião E3 limita a possibilidade de contaminação por fungos. Ao longo embrião criação é fundamental que o cuidado é tomado para remover embriões mortos duas vezes por dia. Além disso, é essencial para lavar cuidadosamente os embriões com meio embrião E3 estéril no dia do início do ensaio. Estes passos 2 limitar o potencial para a contaminação bacteriana dos embriões. A inclusão de poço…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
Referências
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