Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב
Summary
אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.
Abstract
אנו מציגים טכניקה המשלבת במבחנה פרוטוקול הזרקה נותב, אשר עושה שימוש בסדרה של פולסים חשמליים ולחץ כדי להגדיל את ספיגת צבע באמצעות electroporation בexplants המוח עם תאורת לייזר ממוקדת ומשקפי מסנן התאמה במהלך ההליך. הטכניקה המתוארת של electroporation במבחנה על ידי עצמו מניבה שליטה חזותית טובה יחסית לה ממוקדים באזורים מסוימים של המוח. על ידי שילוב של זה עם עירור לייזר של סמנים גנטיים ניאון וקריאה דרך המשקפים מסננים-עובר להקה, שיכול להרים את הפליטה של תאים / גרעינים שכותרתו גנטית וצבע איתור הניאון, חוקר יכול להגדיל באופן משמעותי את דיוקם של זריקות על ידי מציאת השטח של עניין ושליטה לצבע-התפשטות / הספיגה באזור ההזרקה ביעילות רבה יותר. בנוסף, טכניקת תאורת הלייזר מאפשרת ללמוד את הפונקציונליות של neurocircuit ניתנו על ידי providing מידע על הסוג של הנוירונים מקרינים לאזור מסוים במקרים שבהם הביטוי של GFP קשור לסוג של משדר מתבטא בתת-אוכלוסייה של תאי עצב.
Introduction
על מנת להגדיר מעגל מסוים עצבי (מיקרו), יש להתחיל על ידי מציאת המשתתפים השונים של מעגל אמר, ודפוס הקשר שלהם. מאז הפרסום של וולר על neurofiber התחקות דרך lesioning 1 מגוון רחב של טכניקות מעקב neuroanatomical כבר נקבע. חלק מטכניקות אלה ניתן ליישם בנתיחה שלאחר מות רקמות קבועות 2-4, אחרים מסתמכים על התחבורה הפעילה של הצבע בתאי עצב חי, כפי שהתגלו בשנת 1971 5-6. האחרון יכול להיות מחולק חלוקה נוספת בשתי קבוצות להפלות בין שיטות ניצול של מדרדר פעיל (מהאזור המוזרק למקור של הקרנה נתון, כלומר. Somata של נוירונים שמקרינים לאמר אזור) ואנטרוגרדית הפעילה (מהזריק אזור ליעד של הקרנה נתון, כלומר. תחזיות axonal ומסופי axonal של התחבורה) נוירונים שכותרת. כמו כן, במקרים מסוימים traחומר מוזרק לתוך CER בעלי חיים שלאחר מכן לשרוד את הזריקה בכמה ימים או שבועות (בזריקות נותב vivo), ואילו במקרים אחרים מוח explanted מוזרקים ודגירה במשך כמה שעות לאחר ההזרקה בנוזל השדרתי מלאכותי (במבחנה זריקות נותב) .
בפרוטוקול זה אנו שונה קיימים בטכניקת electroporation מבחנה 7-8 לתייג somata ותהליכים עצביים בניסויי אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעות dextran choleratoxin מקטע-ב וtetramethylrhodamine כחומרי התחקות. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק מדעני מוח עם כלי יעיל כדי לעקוב אחר דפוסי קישוריות עצביים בין גרעינים שונים במוח, תוך ניצול קווים זמינים מהונדסים עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק מיקוד במהלך זריקות נותב. למרות שהשיטה של אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעותcholeratoxin והאמין dextran וconjugates שכותרתו fluorescently שלהם הוא לא חדש 9-13 (כמו השיטה של electroporation, למשל. et al האס. 14), השילוב של זריקות נותב עם electroporation בהכנה במבחנה מעורב בלוקים של רקמת המוח הוא התפתחות האחרונה יותר 7. היתרון העיקרי שלה על פני שיטות מעקב עצביות באמצעות אותו הסוג של צבעים נותב בבעלי חיים הוא עוצמת התיוג המוגברת, בשל היעילות גבוהה יותר שבה צבע electroporated הוא נלקח על ידי תאי עצב. יתרון נוסף הוא התקופה המקוצרת הדגירה (הנדרשת להובלת הצבע) ודיוק היעד המוגבר שלה במהלך ההזרקה נותב, כי הנסיין יש שליטה חזותית על אזור היעד של ההזרקה. האחרון גם אומר שאין צורך בציוד יקר stereotactic למצוא את אזור הגרעין או מוח של עניין.
לaddiלהגדיל tionally מיקוד דיוק, אנו ניצלנו קו עכבר מהונדס, המבטא GFP בתת-אוכלוסיית glycinergic של נוירונים 15 וציוד אופטי בסיסי בהיקף של מצביע לייזר כף יד של משקפי סינון אורך גל והתאמת להקה עובר 405 ננומטר (450 – 700 ננומטר). כך, השגנו גידול משמעותי נוסף במיקוד דיוק בזיהוי אזור ההזרקה באמצעות אות הניאון שלה ועל ידי מתן דרך עדינה יותר כדי לשלוט על התפשטות הצבע בתוך אזור ההזרקה באמצעות ההתבוננות באינטראקציה בין אות ה- GFP ילידים ונותבו פלוּאוֹרסצֵנצִיָה. הטכניקה שלנו גם מאפשרת לחשוף את הפונקציונליות של מעגל יחד עם הקישוריות שלה על ידי זיהוי נוירונים מעכבים GFP החיובי (או מעוררת בקווי עכבר אחרים) שהיו מלא בנותבה.
לסיכום, אנו נוספים משופרים כלי נירולוגית מדעי רב עוצמה כדי לחקור connectome של מוח החוליות ולהעריך tהוא תכונות neuroanatomical שונות של neurocircuit נתון. על ידי שימוש בעכברים מהונדסים יחד עם ציוד אופטי זול וזמין באופן נרחב הצלחנו להגביר את דיוק המיקוד שלנו באופן משמעותי הזריקות. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים אפשרו לנו לזהות את סוג הקשרים לייחס, שסייעו לחשוף את הפונקציונליות של microcircuit מעכב בגזע המוח השמיעתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כוח כללי של במבחנה electroporation נותב, בניגוד למחקרי in vivo מעקב, הוא שזה נותן לחוקרי גישה טובה יותר לאזור במוח של עניין ולכן, אינו כרוך stereotactic יקרה (ולעתים קרובות אלקטרו) ציוד. בנוסף, תקופת ההישרדות נדרשת לexplants המוח משתרעת רק כמה שעות (1 – 4) במקום ימים או אפילו שבועות ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמכים על ידי NIH / ניסויי 011582. הדמיה NIDCD R01 DC בוצעו באוניברסיטת קולורדו אנשוץ הרפואי קמפוס האור מתקדם מיקרוסקופית Core נתמך בחלקו על ידי NIH / NCRR קולורדו CTSI גרנט מספר UL1 RR025780 והפרעות Rocky Mountain Neurlogical Core מרכז גרנט NIH P30NS048154. ד"ר Sascha du Lac ממכון סאלק סיפק לנו עכברי GlyT2-GFP.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
Referências
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. . Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
