Hemodinámica Caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar
Summary
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.
Abstract
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease.
Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.
Introduction
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad de la vasculatura pulmonar asociada a la infiltración de células inflamatorias, proliferación de músculo liso y la apoptosis de las células endoteliales. Estos cambios dan lugar a la obliteración de las arteriolas pulmonares, que posteriormente conducen a la disfunción ventricular derecha (RV) y la insuficiencia cardíaca. Con el fin de comprender la fisiopatología de la HAP y la insuficiencia del VD en la HAP, se han desarrollado una serie de diferentes modelos, incluyendo modelos genéticos y farmacológicos, para el estudio de esta enfermedad (revisado en otro 1,2).
De estos modelos, los más populares son la hipoxia inducida (Hx) HAP en el ratón y el monocrotaline (MCT) y modelos SU5416-hipoxia (SuHx) en la rata. En el modelo de Hx ratón, los ratones son expuestos a 4 semanas de la hipoxia (ya sea normobáricas o hipobárica, que corresponde a una altitud de 18.000 pies con una FiO2 de 0,10), con el desarrollo resultante de la proliferación medial, el aumento de Syst RVpresiones Olic y el desarrollo de la hipertrofia RV 3. MCT en una dosis única de 60 mg / kg en los resultados de daño a las células endoteliales pulmonares a través de un mecanismo claro que luego se traduce en el desarrollo de PAH 4. SU5416 es un inhibidor de los receptores endoteliales vasculares del factor de crecimiento (VEGFR) 1 y 2 bloqueador, y el tratamiento con una única inyección subcutánea de 60 mg / kg seguido de exposición a la hipoxia crónica durante 3 semanas resultados en la hipertensión pulmonar permanente con cambios patológicos similares a la observada en la enfermedad humana, con la formación de lesiones vasculares obliterantes 5. En los últimos años, varios modelos de ratones transgénicos para la hipertensión pulmonar se han desarrollado. Estos incluyen knockout y las mutaciones de la proteína morfogenética ósea del receptor 2 (BMPR2), como las mutaciones del gen BMPR2 se encuentran tanto en las formas familiares y idiopáticas de PAH, hemo oxigenasa-1 knockout y IL-6 sobreexpresión (revisado en otra parte 1,2).
Estos diferentes modelos de roedores de PH tienen diferentes niveles de hipertensión pulmonar, hipertrofia del VD y la insuficiencia del VD. Mientras que los diversos modelos de ratones transgénicos hipoxia y el resultado en la HAP mucho más suave que el modelo de rata o bien 1, no se permite la comprobación de diferentes mutaciones genéticas y sus vías de señalización moleculares asociados. El modelo MCT resulta en PAH grave, aunque MCT parece ser tóxico para las células endoteliales en múltiples tejidos 4. El modelo se caracteriza por SuHx vascular cambia más similar a la observada en la HAP idiopática en humanos, aunque requiere tanto la manipulación y la hipoxia farmacológico exposición. Además, en todos estos modelos, puede haber una desconexión entre los cambios histopatológicos, presiones pulmonares y la función del VD asociados con el desarrollo de la HAP. Esto está en contraste con la enfermedad humana, donde por lo general hay una relación proporcional entre los cambios histopatológicos, la gravedad de pulmonary la hipertensión y el grado de insuficiencia del VD. Por lo tanto, se requiere una caracterización completa de estos modelos de roedores de PH, y consiste en la evaluación de la función ventricular derecha (normalmente mediante ecocardiografía), la hemodinámica (por cateterismo cardíaco) y la histopatología del corazón y los pulmones (a partir de la cosecha de tejidos).
En este protocolo, se describen las técnicas básicas utilizadas para la caracterización hemodinámica de los modelos de PAH en la rata y el ratón. Estas técnicas generales se pueden aplicar a cualquier estudio del ventrículo derecho y la vasculatura pulmonar y no se limita a los modelos de PAH. Visualizando el RV por ecocardiografía es relativamente sencillo en ratas, pero es más difícil en los ratones debido a su tamaño y la geometría compleja de la RV. Por otra parte, algunos sustitutos utilizados para la cuantificación de la función del VD, como TAPSE, la arteria pulmonar (AP) tiempo de aceleración y PA Doppler muescas en forma de onda, no están bien validados en los seres humanos y se correlacionan débilmente con la evaluación de la PUhipertensión lmonary y la función del VD por la hemodinámica invasiva. Determinación de la hemodinámica RV se realiza mejor con un cerrado-pecho, para mantener los efectos de una presión intratorácica negativa con la inspiración, aunque cateterismo pecho abierto con un catéter de impedancia permite la determinación de la presión-volumen (PV) bucles y una caracterización hemodinámica más detallada . Al igual que con cualquier procedimiento, el desarrollo de la experiencia con los procedimientos es fundamental para el éxito experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocols outlined here describe a comprehensive characterization of hemodynamics and right ventricular function in rodent models of pulmonary hypertension. While right heart catheterization as described here is a terminal procedure, the mortality associated with echocardiography is minimal, which allows for screening and follow-up of disease progression. However, similar to patients with PH having markedly increased mortality with anesthesia17, in our experience, rats with severe PH do not tolerate anesth…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR is supported by NIH K08HL114643, Gilead Research Scholars in Pulmonary Arterial Hypertension and a Burroughs Wellcome Fund Career Award for Medical Scientists.
Materials
| Vevo 2100 Imaging System (120V) | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo 2100 Imaging Station | VisualSonics, inc. | ||
| High-frequency Mechanical Transducers | VisualSonics, inc. | MS250, MS550D, MS400 | |
| Ultrasound Gel Parker | Laboratories Inc. | 01-08 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | ML765 | |
| Labchart 8 | ADInstruments | ||
| BP transducer with stopcock and cable | ADInstruments | MLT1199 | |
| BP transducer calibration kit | ADInstruments | MLA1052 | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter for mouse | Millar | SPR-1000 | Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat) |
| Mikro-Tip Pressure Catheter for rat | Millar | SPR-513 | Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat) |
| Millar Mikro-Tip ultra-miniature PV loop catheter for mice | Millar | PVR-1035 | Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse) |
| Millar Mikro-Tip ultra miniature PV loop catheter for rats | Millar | SPR-869 | Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse) |
| Millar PV system MPVS-300 | Millar | MPVS-300 | |
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical | SUT-15-2 | |
| 6-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical | SUT-14-1 | |
| Iris Scissors, Delicate, Integra Miltex | VWR | 21909-248 | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-588 | |
| VWR Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Two star Hemostats, Excelta | VWR | 63042-090 | |
| Neutral-buffered formalin | VWR | 89370-094 | |
| Crotaline | Sigma | C2401 | |
| SU5416 | Tocris Biosciences | 3037 | |
| 3.5X-45X Boom Stand Trinocular Zoom Stereo Microscope | AmScope | SM-3BX | |
| PE (Polyethylene Tubing)-10 | Braintree Scientific Inc | PE10 36 FT | |
| PE (Polyethylene Tubing)-50 | Braintree Scientific Inc | PE50 36 FT | |
| PE (Polyethylene Tubing)-60 | Braintree Scientific Inc | PE60 36 FT | |
| Tabletop Isoflurane Anesthesia Unit | Kent Scientific | ACV-1205S | |
| Surgisuite multi-functional surgical platform | Kent Scientific | Surgisuite | |
| Retractor set | Kent Scientific | SURGI-5002 | |
| Anesthesia induction chamber | VetEquip | 941443 | |
| Anesthesia Gas filter canister | Kent Scientific | ACV-2001 | |
| Rodent nose cone | VetEquip | 921431 |
Referências
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