L'eau dans l'huile Emulsions: un nouveau système d'assemblage des protéines Chlorophylle liaison solubles dans l'eau avec Pigments hydrophobes
Summary
Ce manuscrit décrit une méthode simple et à haut débit pour l'assemblage des protéines solubles dans l'eau avec des pigments hydrophobes qui est basée sur des émulsions eau-dans-huile. Nous démontrons l'efficacité de la méthode dans l'ensemble des chlorophylles indigènes avec quatre variantes de l' eau-soluble dans la chlorophylle recombinante des protéines de liaison (WSCPs) de plantes Brassica exprimé dans E. coli.
Abstract
Chlorophylles (CHLS) et bactériochlorophylles (BCHLS) sont les cofacteurs primaires qui effectuent la récolte de lumière photosynthétique et de transport d'électrons. Leur fonctionnalité dépend essentiellement de leur organisation spécifique au sein de grandes et complexes complexes protéiques multimérique transmembranaires. Afin de comprendre au niveau moléculaire comment ces complexes facilitent la conversion de l'énergie solaire, il est essentiel de comprendre la protéine-pigment, et les interactions pigment pigment, et leur effet sur la dynamique excités. Une façon d'obtenir une telle compréhension est par la construction et à l'étude des complexes de CHLS avec des protéines recombinantes solubles dans l'eau simples. Cependant, l'incorporation des CHLS et BCHLS lipophiles dans les protéines solubles dans l'eau est difficile. De plus, il n'y a pas de méthode générale qui pourrait être utilisé pour l'assemblage des protéines solubles dans l'eau avec des pigments hydrophobes. Ici, nous démontrons un système de débit simple et haute à base d'émulsions eau dans l'huile, ce qui permet le culembly de protéines solubles dans l'eau avec CHLS hydrophobes. La nouvelle méthode a été validée par l' assemblage des versions recombinantes de la protéine de liaison à la chlorophylle soluble dans l'eau des plantes brassicacées (WSCP) avec un Chl. Nous démontrons l'assemblage réussi de Chl a l' aide de lysats bruts de WSCP exprimant E. cellule coli, qui peut être utilisé pour le développement d' un système de criblage génétique pour de nouvelles protéines Chl liant soluble dans l'eau, et pour l' étude des interactions Chl-protéine et des procédés d'assemblage.
Introduction
des pigments hydrophobes tels que les chlorophylles (CHLS), bactériochlorophylles (Bchl) et caroténoïdes sont des cofacteurs primaires dans les centres réactionnels photosynthétiques et les protéines de récolte de lumière qui effectuent le transport d'électrons, et la capture de l'énergie lumineuse et de transfert. Les centres réactionnels et la plupart des antenne collectrice CHL-liaison sont des protéines transmembranaires. La protéine Fenna-Matthews-Olson (FMO) des bactéries vert-soufre photosynthétique non oxygénés 1,2, et la protéine péridinine-Chl (PCP) de dinoflagellés 3 sont des exemples exceptionnels de protéines lumière de récolte solubles dans l'eau. La liaison chlorophylle protéines solubles dans l'eau (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chénopodiacées et plantes Amaranthacées 4, 5 sont un autre exemple unique, mais contrairement à FMO et le PCP, ceux – ci ne sont ni impliqués dans la récolte de lumière ni dans aucun de la réaction photosynthétique primaire et leur phy précisefonctions siologique sont pas encore claires 5-8. Leur grande affinité Chl liaison ont conduit à une fonction proposée en tant que porteurs transitoires de CHLS et dérivés de Chl 9,10. Alternativement, il a émis l' hypothèse que WSCP joue un rôle dans la récupération des CHLS dans les cellules endommagées et protège contre les dommages photooxydation Chl-induite 7,11-13. Plus récemment, il a été suggéré que les fonctions de WSCP comme un inhibiteur de protéase et joue un rôle lors de la résistance à l'herbivore et régule la mort cellulaire au cours du développement de la fleur 14. WSCPs sont divisés en deux grandes catégories en fonction de leurs propriétés photophysiques. La première classe (classe I, par exemple. De Chenopodium album) peut subir photoconversion lors de l' illumination. WSCPs de classe II à partir de plantes Brassica, qui ne subissent pas photoconversion 5,10, sont subdivisées en classe IIa (par exemple., De Brassica oleracea, Raphanus sativus) et IIb (par ex., À partir de Lepidium virginicum </em>). La structure de la classe IIb WSCP de Lepidium virginicum a été résolu par cristallographie aux rayons X à une résolution de 2,0 Å 8. Elle révèle une homotétramère symétrique dans laquelle les sous-unités protéiques forment un noyau hydrophobe. Chaque sous-unité se lie un seul Chl qui se traduit par un arrangement serré de quatre CHLS serrées dans les core.This simples tout arrangement Chl fait WSCPs un système modèle potentiellement utile pour l'étude de la liaison et l'assemblage de complexes Chl-protéine, et les effets de CHLS voisins et les environnements de protéines sur les propriétés spectrales et électroniques de CHLS individuels. En outre, il peut fournir des modèles de construction de protéines artificielles Chl de liaison qui peuvent être utilisés pour des modules collecteurs de lumière dans les dispositifs photosynthétiques artificiels.
Des études rigoureuses de WSCPs natifs ne sont pas réalisables parce que les complexes purifiés à partir de plantes contiennent toujours un mélange hétérogène de tétramères avec différentes combinaisons de Chl aet Chl b 9. Ainsi, un procédé d'assemblage WSCPs exprimées par recombinaison in vitro avec CHLS est nécessaire. Ceci est contesté par la solubilité dans l' eau négligeable de CHLS ce qui rend impossible d'assembler le complexe in vitro en mélangeant simplement les apoprotéines solubles dans l'eau avec des pigments dans des solutions aqueuses. Assemblage in vitro en mélangeant les apoprotéines avec membranes thylacoïdes 15 a été démontrée, mais cette méthode est limitée à l'indigène CHLS présent dans les thylakoïdes. Schmidt et al. rapport sur l' assemblage de plusieurs dérivés de Chl et BChl avec WSCP de chou – fleur (CaWSCP) en exprimant une protéine recombinante marquée à l' histidine dans E. coli immobilisant sur une colonne Ni-affinité et l' introduction de dérivés de Chl solubilisés dans les détergents 11. Réussir reconstitution de WSCPs recombinants de A. thaliana 6, et les choux de Bruxelles (BoWSCP), radis sauvage japonais (RshWSCP) und Virginia pepperweed (LvWSCP) par un procédé similaire ont également été signalés.
Ici, nous présentons un roman, général, méthode simple pour l'assemblage CHLS avec WSCP qui ne nécessitent pas de marquage ou immobilisant les protéines. Elle repose sur la préparation d'émulsions à partir de leurs solutions aqueuses des apoprotéines solubles dans l'eau dans de l'huile minérale. Les protéines sont ainsi encapsulés dans (E / H) avec des micro – gouttelettes très grande surface dans l'huile dans l'eau à rapport volumétrique 16. Les cofacteurs hydrophobes sont ensuite dissous dans l'huile et sont facilement introduits dans les gouttelettes de la phase huileuse. Nous rapportons sur l' utilisation du procédé d'assemblage de plusieurs variantes de apoprotéines WSCP exprimées par recombinaison dans E. coli avec un Chl. Nous démontrons l'ensemble du lysat brut de bactéries WSCP surexprimant qui peuvent être utilisés en tant que système de criblage pour le développement de nouvelles protéines de liaison Chl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre objectif était de développer un nouveau système général pour l'assemblage des protéines de chlorophylle liant soluble dans l'eau avec des pigments hydrophobes. Ici , il est indiqué que le nouveau système de reconstitution basée sur émulsion E / H est une approche générale éprouvée à travailler pour l' assemblage des apoprotéines WSCP de choux de Bruxelles, chou – fleur, raifort japonais et Virginia pepperweed exprimées par recombinaison dans E. coli. Voici les résultats sont …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN reconnaît le soutien de projets européens FP7 PEPDIODE (GA 256672) et REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), et une subvention de recherche personnelle (n ° 268/10) de la Science Foundation Israël. Nous remercions le Pr Shmuel Rubinstein, École d'ingénierie et de sciences appliquées, Université de Harvard, Cambridge MA, États-Unis pour prendre les images de microscopie confocale.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
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