油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム
Summary
この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。
Abstract
クロロフィル（Chl類）およびバクテリオ（Bchl類）は光合成集光と電子輸送を行う主要な補因子です。これらの機能は、批判的に大規模と精巧なマルチサブユニット膜貫通タンパク質複合体内での特定の組織に依存します。これらの複合体は、太陽エネルギーの変換を促進する方法を分子レベルで理解するためには、蛋白質顔料、および顔料色素相互作用、励起ダイナミクスへの影響を理解することが不可欠です。このような理解を得る一つの方法は、単純な水溶性組換えタンパク質とChl類の複合体を構築し、研究することによってです。しかし、水溶性タンパク質に親油性Chl類及びBchl類を組み込むことは困難です。また、疎水性の顔料と水溶性タンパク質のアセンブリのために使用することができない一般的な方法は存在しません。ここでは、お尻を可能にする、油中水型エマルジョンに基づく単純かつ高スループットのシステムを示します疎水性のChl類と水溶性タンパク質のembly。新しい方法は、クロロフィルとアブラナ科植物 （WSCP）の水溶性クロロフィル結合タンパク質の組換え型を組み立てることによって検証されました。私たちは、クロロフィルの成功アセンブリをE.を表現WSCPの使用して粗溶解物を実証します新規な水溶性のクロロフィル結合タンパク質のための、およびクロロフィル-タンパク質相互作用及び組立プロセスの研究のための遺伝子スクリーニングシステムを開発するために使用することができる大腸菌細胞。
Introduction
このようなクロロフィル（Chl類）、バクテリオ（Bchl類）およびカロテノイドのような疎水性顔料は、電子輸送、及び光エネルギーの取り込みと転送を行う光合成反応中心と集光性タンパク質中の主要な補因子です。反応中心およびCH1結合集光複合体の大部分は膜貫通タンパク質です。非酸素発生型光合成緑色硫黄細菌1,2のFenna-マシューズ-オルソン（FMO）タンパク質、および渦鞭毛藻類3のペリジニン-クロロフィルタンパク質（PCP）は、水溶性の集光タンパク質の例外的な例です。水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs） アブラナ科 、 タデ 、 アカザ科のとヒユ科の植物は4、5は、別のユニークな例であり、まだFMOとPCPとは対照的に、これらは、光の収穫にも主要な光合成反応のいずれかの中にも関与しています、およびそれらの正確なPHYsiological機能はまだ5-8不明です。彼らの高クロロフィル結合親和性はChl類及びクロロフィル誘導体の9,10の一過性の担体として示唆された機能につながっています。あるいは、WSCPが損傷を受けた細胞内でChl類を捕捉する役割を果たし、クロロフィルによって誘発される光酸化損傷7,11-13から保護するという仮説が立てられました。最近では、それはプロテアーゼ阻害剤としてのそのWSCP機能を提案し、草食性の間に役割を果たしているだけでなく花の開発14の間の細胞死を調節しました。 WSCPsは、それらの光物理的特性に応じて2つの主なクラスに分けられます。最初のクラス（クラスI、 例えば シロザから）は、照明時に光変換を受けることができます。クラスII、さらなるクラスIIa族に細分化されている（ 例えば 、 キャベツ、ダイコンから）光変換5,10を受けないアブラナ属植物からWSCPsおよびIIb（ 例えば 、 マメグンバイナズナから</eM>）。 Lepidiumのvirginicumからクラス第IIb WSCPの構造は2.0Å分解能8のX線結晶学によって解決しました。これは、タンパク質サブユニットは、疎水性コアを形成する対称ホモ四量体を明らかにしています。各サブユニットは、単純なcore.This内の4つの密に詰まったChl類の密な配置になり、単一のクロロフィルは、すべてのクロロフィルの配置がWSCPsクロロフィル – タンパク質複合体の結合および組み立てを研究するための潜在的に有用なモデルシステム、および隣接Chl類の効果を作る結合しそして個々のChl類のスペクトルと電子物性上のタンパク質環境。また、人工光合成素子で集光モジュールに使用することができる人工のクロロフィル結合タンパク質を構築するためのテンプレートを提供することができます。
植物から精製された複合体は常にクロロフィルaの異なる組み合わせで四量体の不均一な混合物が含まれているため、ネイティブWSCPsの厳密な研究が実現可能ではありませんそして、クロロフィルbの9。したがって、 インビトロで Chl類と組換え的に発現WSCPsを組み立てるための方法が必要とされます。これは、 インビトロ組立体15が示されたチラコイド膜とアポタンパク質とを混合することによってそれができないだけで、水溶液中で顔料と水溶性のアポタンパク質を混合することによってin vitroで複合体をアセンブルすることができるChl類のごくわずかな水溶解度挑戦しているがこの方法は、チラコイド内のネイティブChl類の存在に限定されています。シュミットら 。組換えにより大腸菌にヒスチジンタグ付きタンパク質を発現させることによってカリフラワー（CaWSCP）からWSCPで、いくつかのクロロフィルとのBchl誘導体を組み立てる上で報告大腸菌は、Ni-アフィニティーカラム上にそれを固定化し、洗浄剤11中に可溶化クロロフィル誘導体を導入します。 A.からの組換えWSCPsのに成功しました再構成シロイヌナズナ 6、および芽キャベツ（BoWSCP）、日本の野生ダイコン（RshWSCP）AN同様の方法により、Dバージニアpepperweed（LvWSCP）も報告されました。
ここでは、小説、タンパク質をタグ付けを必要としないWSCPとChl類を組み立てるまたは固定化するための一般的な、簡単な方法を提示します。これは、鉱油中の水溶性アポタンパク質のそれらの水溶液からエマルションを調製するに依存しています。タンパク質は、このように体積比16に非常に高い表面積を有する油中水型（W / O）微小液滴中に封入されています。疎水性の補因子は、次いで、油中に溶解され、容易に油相から液滴に導入されます。我々は、組換えE.で表現WSCPアポタンパク質のいくつかの変異体の組立方法を使用してについて報告しますクロロフィルを持つ大腸菌 。我々は、新規のクロロフィル結合タンパク質を開発するためのスクリーニング系として使用することができるWSCP過剰発現細菌の粗溶解物からアセンブリを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの目標は、疎水性の顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質の組み立てのための新しい一般的なシステムを開発することでした。ここでは、W / Oエマルションに基づいて、新たな再構成システムは、組換えE.で表現芽キャベツ、カリフラワー、わさびとバージニアpepperweedからWSCPアポタンパク質のアセンブリのために働くことが証明の一般的なアプローチであることが示されて?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNは、EU FP7プロジェクトのPEPDIODE（GA 256672）とREGPOT-2012-2013-1（GA 316157）、およびイスラエル科学財団からの個人研究助成金（第10分の268）からの支援を認めています。我々は、共焦点顕微鏡画像を撮影するための教授シュムエルルビンスタイン、工学応用科学の学校、ハーバード大学、ケンブリッジMA、USAに感謝します。
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
Referências
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Bioquímica. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
