Vann i olje emulsjoner: Et nytt system for Montering Vannløselige Klorofyll bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter
Summary
Dette manuskriptet beskriver en enkel og high-throughput fremgangsmåte for sammenstilling av vannløselige proteiner med hydrofobe pigmenter som er basert på vann-i-olje-emulsjoner. Vi viser effektiviteten av fremgangsmåten i monteringen av innfødte klorofyll med fire varianter av rekombinant vannoppløselig-klorofyll bindende proteiner (WSCPs) av Brassica planter uttrykt i E. coli.
Abstract
Klorofyll (Chls) og bacteriochlorophylls (BChls) er de primære kofaktorer som utfører foto lys høsting og elektrontransport. Deres funksjonalitet kritisk avhengig av deres spesifikke organisasjon innen store og forseggjorte multisubunit transmembrane protein komplekser. For å forstå på molekylnivå hvordan disse kompleksene lette solenergi konvertering, er det viktig å forstå protein-pigment og pigmentpigment interaksjoner, og deres effekt på glade dynamikk. Én måte å få en slik forståelse er ved å konstruere og å studere komplekser av Chls med enkle vannoppløselige rekombinante proteiner. Imidlertid, som omfatter de lipofile Chls og BChls til vannoppløselige proteiner er vanskelig. Videre er det ingen generell metode, som kan brukes for montering av vannløselige proteiner med hydrofobe pigmenter. Her viser vi en enkel og høy gjennomstrømning system basert på vann-i-olje-emulsjoner, som muliggjør assembly av vannløselige proteiner med hydrofobe Chls. Den nye metoden ble validert ved sammensetting av rekombinante versjoner av det vannoppløselige klorofyll bindende protein av Kors planter (WSCP) med Chl a. Vi demonstrerer vellykket montering av Chl pt bruker grove lysates av WSCP uttrykker E. coli-celle, som kan brukes for å utvikle et genetisk system skjerm for nye vannoppløselige Chl-bindende proteiner, og for studier av Chl-protein interaksjoner og monteringsprosesser.
Introduction
Hydrofobe pigmenter som klorofyll (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) og karotenoider er de primære kofaktorer i fotosyntesereaksjonssentre og lette høsting proteiner som utfører elektrontransport, og lysenergi fangst og transport. Reaksjonssentre og de fleste av de CHL-bindende lette høsting komplekser er transmembrane proteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein av ikke-oxygenic foto grønn-svovelbakterier 1,2, og peridinin-CHL protein (PCP) av dinoflagellater 3 er enestående eksempler på vannløselige lys høsting proteiner. De vannløselige klorofyll bindende proteiner (WSCPs) av Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae og Amaranthaceae planter 4, 5 er en annen unik eksempel, men i motsetning til FMO og PCP, disse er heller ikke involvert i lys høsting eller i en hvilken som helst av de primære fotoreaksjons og deres presise grafisiological funksjoner er ennå uklart 5-8. Deres høy CHL-bindende affinitet har ført til en veiledende funksjon som forbigående bærere av Chls og CHL derivater 9,10. Alternativt, ble det antatt at WSCP spiller en rolle i spyle Chls i skadede celler og beskytter mot CHL-indusert photooxidative skade 7,11-13. I den senere tid ble det foreslått at WSCP virker som en protease-inhibitor, og spiller en rolle i løpet av planteeter motstand samt regulerer celledød under blomsterutvikling 14. WSCPs er delt inn i to hovedklasser i henhold til deres photophysical egenskaper. Den første klassen (klasse I, f.eks. Fra Chenopodium album) kan gjennomgå photoconversion ved belysning. Klasse II WSCPs fra Brassica planter, som ikke gjennomgår photoconversion 5,10, er videre inndelt i klasse IIa (f.eks., Fra kål, Raphanus sativus) og IIb (f.eks., Fra Lepidium virginicum </em>). Strukturen i klasse IIb WSCP fra Lepidium virginicum ble løst ved røntgenkrystallografi på 2,0 Å oppløsning 8. Det avslører en symmetrisk homotetramer hvori proteinunderenheter danner en hydrofob kjerne. For hver underenhet binder et enkelt Chl som resulterer i en tett anordning av fire tettpakkede Chls innenfor de core.This enkel alle Chl arrangement gjør WSCPs en potensielt nyttig modellsystem for å studere bindingen og montering av Chl-proteinkomplekser, og virkningene av nærliggende Chls og protein miljøer på de spektrale og elektroniske egenskaper til individuelle Chls. Videre kan det tilveie maler for å konstruere kunstige Chl-bindende proteiner som kan anvendes for lette innhøsting av moduler i kunstige fotosyntetiske enheter.
Strenge studier av innfødte WSCPs er ikke gjennomførbart fordi kompleksene renset fra planter alltid inneholde en heterogen blanding av tetramers med ulike kombinasjoner av CHL ptog Chl b 9. Således kreves en fremgangsmåte for sammenstilling av rekombinant uttrykt WSCPs med Chls in vitro. Dette er utfordret av ubetydelig vannløselighet Chls som gjør det umulig å montere komplekset in vitro ved ganske enkelt å blande de vannoppløselige apoproteiner med pigmenter i vandige oppløsninger. In vitro-sammenstillingen ved å blande de apoproteiner med thylakoid membraner 15 ble påvist, men denne metoden er begrenset til den native Chls stede i thylakoids. Schmidt et al. rapportert om montering flere CHL og BChl derivater med WSCP fra blomkål (CaWSCP) ved rekombinant uttrykker en histidin-merket protein i E. coli immobilisere det på en Ni-affinitetskolonne og innføring av CHL-derivater oppløst i vaskemidler 11. Vellykket rekonstituering av rekombinante WSCPs fra A. thaliana 6, og rosenkål (BoWSCP), japansk vill reddik (RshWSCP) end Virginia pepperweed (LvWSCP) ved en lignende metode ble også rapportert.
Her presenterer vi en ny, generell, grei metode for montering Chls med WSCP som ikke krever merking eller immobilisering proteiner. Det er avhengig av å fremstille emulsjoner fra deres vandige oppløsninger av de vannoppløselige apoproteiner i mineralolje. Proteinene blir således innkapslet i vann-i-olje (W / O) mikrodråper med svært høy overflate til volum-forhold 16. De hydrofobe kofaktorer blir deretter oppløst i oljen og kan lett innføres i dråpene fra oljefasen. Vi rapporterer om bruk av metode for montering av flere varianter av WSCP apoproteiner rekombinant uttrykt i E. coli med Chl a. Vi viser sammenstillingen fra rått lysat fra WSCP-overuttrykkende bakterier som kan anvendes som et screening-system for å utvikle nye CHL-bindende proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt mål var å utvikle en ny generell ordning for montering av vannløselige klorofyll bindende proteiner med hydrofobe pigmenter. Her er det vist at det nye tilberedning system basert på W / O-emulsjon er en generell tilnærming vist seg å fungere for montering av WSCP apoproteiner fra rosenkål, blomkål, japansk pepperrot og Virginia pepperweed rekombinant uttrykt i E. coli. Her resultatene er presentert fra rekonstituering av 1 mg WSCP med 10-ganger molart overskudd av Chl a. Men det er også …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN erkjenner støtte fra EU FP7 prosjekter PEPDIODE (GA 256 672) og REGPOT-2012-2013-1 (GA 316 157), og en personlig forskningsstipend (nr 268/10) fra Israel Science Foundation. Vi takker professor Shmuel Rubinstein, School of Engineering og Applied Sciences, Harvard University, Cambridge, MA, USA for å ta konfokalmikroskopi bilder.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
Referências
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Bioquímica. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
