Emulsões água em óleo: Um novo sistema para a montagem de proteínas de ligação de clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos

Summary

Este manuscrito descreve um método simples e de alto rendimento para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos que é base de emulsões de água-em-óleo. Demonstramos a eficácia do método na montagem de clorofilas nativas com quatro variantes de água-solúvel em clorofila recombinante proteínas de ligação (WSCPs) de plantas Brassica expressos em E. coli.

Abstract

Clorofilas (CHLS) e bacteriochlorophylls (Bchls) são os principais co-fatores que realizam a colheita de luz da fotossíntese e de transporte de elétrons. Sua funcionalidade depende criticamente sobre a sua organização específica dentro grandes complexos de proteínas e elaborados múltiplas subunidades transmembrana. A fim de compreender a nível molecular destes complexos como facilitar a conversão da energia solar, que é essencial para compreender proteína de pigmento, e interacções pigmento de pigmento, e o seu efeito sobre a dinâmica excitados. Uma maneira de ganhar tal entendimento é através da construção e estudar complexos de Chis com proteínas recombinantes solúveis em água simples. No entanto, a incorporação dos Chis e Bchls lipofílicos em proteínas solúveis em água, é difícil. Além disso, não existe um método geral que pode ser utilizado para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui, demonstramos um sistema de transferência simples e alta à base de emulsões de água-em-óleo, o qual permite burroembly de proteínas solúveis em água com Chis hidrofóbicos. O novo método foi validado por reunião de versões recombinantes da proteína de ligação à clorofila solúvel em água de plantas Brassicaceae (WSCP) com Chl a. Nós demonstramos a montagem bem-sucedida de Chl A utilizando lisados ​​impuros de WSCP expressando E. célula de E. coli, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de um sistema de tela genética para as proteínas de ligação Chl-solúveis em água novos, e para estudos de interacções proteína-Chl e processos de montagem.

Introduction

pigmentos hidrofóbicos, tais como clorofilas (CHLS), bacteriochlorophylls (Bchls) e carotenóides são os principais cofatores na centros de reação fotossintética e proteínas de colheita de luz que realizam transporte de elétrons, e captura de energia de luz e transferência. Os centros de reação e a maior parte dos complexos de colheita de luz Chl-ligação são proteínas transmembrana. A proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de não oxigênicos bactérias fotossintéticas-enxofre verde ^1,2 e a proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados ³ são exemplos excepcionais de proteínas de colheita de luz solúveis em água. A ligação de clorofila proteínas solúveis em água (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae e plantas Amaranthaceae ^{4, 5} são outro exemplo único, mas em contraste com FMO e PCP, estes não são nem envolvidos na captura de luz nem em qualquer um dos reacção fotossintética primária e sua phy precisafunções fisiológi- são ainda incerto ^5-8. A sua afinidade de ligação a Chl elevada conduziram a uma função sugerida como transportadores transientes de Chis e derivados de Chi ^9,10. Alternativamente, se a hipótese de que WSCP desempenha um papel importante na limpeza Chis em células danificadas e protege contra danos induzidos photooxidative-Chl ^7,11-13. Mais recentemente, sugeriu-se que as funções de WSCP como um inibidor de protease e desempenha um papel na resistência herbívoros assim regula a morte celular durante o desenvolvimento da flor ^14. WSCPs são divididos em duas classes principais de acordo com as suas propriedades fotofísicas. A primeira classe (classe I, por exemplo. De Chenopodium album) pode sofrer fotoconversão sobre iluminação. Classe WSCPs II de plantas Brassica, que não se submetem a fotoconversão ^5,10, estão subdivididos em classes IIa (ex., A partir de Brassica oleracea, Raphanus sativus) e IIb (por exemplo., De Lepidium virginicum </em>). A estrutura da classe IIb WSCP de Lepidium virginicum foi resolvida por cristalografia de raios-X em resolução de 2.0 a ^8. Ela revela um homotetrâmero simétrica em que as subunidades da proteína formar um núcleo hidrofóbico. Cada subunidade se liga a um único Chl o que resulta em um arranjo apertado de quatro Chis estreitamente empacotadas dentro das core.This simples arranjo todos Chl faz WSCPs um sistema modelo potencialmente útil para o estudo de ligação e montagem de complexos de Chl-proteína, e os efeitos da vizinha Chis e ambientes de proteína sobre as propriedades espectrais e eletrônicas de Chis individuais. Além disso, pode fornecer modelos para a construção de proteínas Chl vinculativos artificiais que podem ser utilizados para os módulos de luz de colheita em dispositivos fotossintéticos artificiais.

Estudos rigorosos de WSCPs nativas não são viáveis ​​porque os complexos purificados a partir de plantas contêm sempre uma mistura heterogénea de tetrâmeros com diferentes combinações de Chl ae Chl b ^9. Assim, um método para a montagem de WSCPs expressos de forma recombinante com Chis in vitro é necessário. Este é desafiada pela solubilidade em água desprezável de Chis que faz com que seja impossível montar o complexo in vitro misturando simplesmente as apoproteínas solúveis em água com pigmentos em soluções aquosas. Montagem in vitro misturando as apoproteínas com membranas de tilacóides ¹⁵ foi demonstrada, mas este método é limitado à Chis nativa presente nos tilacóides. Schmidt et ai. informou sobre a montagem de vários derivados de Chi e de Bchl com WSCP de couve-flor (CaWSCP), expressando de forma recombinante uma proteína marcada com histidina em E. coli imobilizando-o sobre uma coluna de Ni-afinidade e a introdução de derivados de Chi solubilizados em detergentes ^11. Com sucesso reconstituição do WSCPs recombinantes de A. thaliana ^6, e couves de Bruxelas (BoWSCP), nabo japonês (RshWSCP) umd Virgínia pepperweed (LvWSCP) por um método semelhante foram também relatados.

Aqui, apresentamos um romance, método geral, direto para a montagem de Chis com WSCP que não requerem marcação ou imobilizar as proteínas. Baseia-se na preparação de emulsões de suas soluções aquosas dos apoproteínas solúveis em água, em óleo mineral. As proteínas são assim encapsulados em água-em-óleo (W / O) microgotículas com superficial muito elevada em relação ao volume ^{de 16.} Os cofactores hidrofóbicos são, em seguida, dissolvido no óleo e são facilmente introduzidos nas gotículas da fase oleosa. Relatamos usando o método para a montagem de diversas variantes de apoproteínas WSCP recombinante expressos em E. coli com Chl a. Nós demonstramos a montagem a partir de lisados ​​em bruto de bactérias que sobre-expressam WSCP que podem ser utilizados como um sistema de rastreio para o desenvolvimento de novas proteínas de ligação de Chl.

Protocol

1. Preparar Chl um estoque Solutions Passo crítico: executar todos os passos de preparação de clorofila numa hote química, sob luz verde (520 nm) ou, no escuro, a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Sempre adicionar azoto ou árgon antes de congelar os pigmentos para armazenamento. Assegurar que todos os solventes são grau analítico. Pesar cerca de 5 mg de células Spirulina platensis liofilizadas ou outras células contendo apenas cianobactéria Chl a em tilacóides e esm…

Representative Results

Apoproteínas WSCP recombinantes foram montados com um Chl em emulsões / O w de acordo com o protocolo descrito na secção anterior. O protocolo foi implementado utilizando fases aquosas contendo os WSCPs puros, ou lisados ​​de células de E. coli que sobre-expressam WSCP (Figura 1). O protocolo é simples, rápida e não requer qualquer equipamento especial, exceto um homogeneizador de tecidos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-…

Discussion

O nosso objectivo foi desenvolver um novo sistema para a montagem geral de proteínas de ligação a clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui mostra-se que o novo sistema de reconstituição com base em W / O emulsão é uma abordagem geral comprovada para o trabalho para a montagem de apoproteínas WSCP de couves de Bruxelas, couve-flor, rabanete japonês e Virginia pepperweed recombinante expressos em E. coli. Aqui os resultados são apresentados a partir de reconstituição de 1 mg de W…

Materials

Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification