O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a separação de esporos bacterianos, a partir de células bacterianas vegetativas em amostras ambientais. A formação de esporos bacterianos é uma estratégia de sobrevivência, geralmente desencadeado pela inanição, encontrado num número de grupos de bactérias pertencentes ao filo Firmicutes 1. Bactérias formadoras de Endospore são bem estudadas, principalmente porque um número de cepas são agentes patogênicos e, portanto, de importância médica (por exemplo, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Estirpes ambientais de bactérias formadoras de endospore foram isolados a partir de praticamente qualquer ambiente (solo, água, sedimentos, o ar, gelo, intestino humano, animais intestino, e mais) 1-3. Portanto, Firmicutes são a segunda filo mais abundante em coleções de cultura 4.
Por causa de suas proteínas córtex externo e do núcleo de protecção resistentes, endospores podem sobreviver a condições ambientais extremas que vão from dessecação à alta radiação, temperaturas extremas e produtos químicos prejudiciais 5. Este notável resistência torna-se um desafio para extrair DNA de endósporos 6-8. Isso provavelmente explica por que eles têm sido negligenciados nos estudos de sequenciamento ambiental 9,10. Outros métodos, tais como a concentração de endósporos em amostras ambientais por anticorpos fluorescentes 11, a quantificação de ácido dipicolínico (DPA) no solo e nos sedimentos 13 12, por citometria de fluxo 14 ou a pasteurização e cultivo subsequente 15,16 têm sido usados para obter ou quantificar em endosporos amostras ambientais. Em anos recentes, os métodos de extracção de ADN optimizada, bem como iniciadores moleculares específicos para sequências alvo específicas do gene endospore foram desenvolvidos 10,17-20. Isto tem ajudado a revelar mais biodiversidade entre este grupo de bactérias e 21 também levou a aplicações na indústria e medicina para a detecção de endospores, Por exemplo, em leite em pó 19.
O protocolo aqui apresentado é baseado na diferença em resistência às condições físico-químicas prejudiciais (tais como o calor e detergentes) de endosporos bacterianos relativos a células vegetativas. Para destruir as células vegetativas em uma amostra, consecutivamente aplicar calor, lisozima e baixas concentrações de detergentes. O tempo e a força destes tratamentos foram optimizadas de forma a não destruir os esporos, mas de lisar todas as células vegetativas. Algumas células em uma piscina de células ambiental são mais resistentes do que outros, por isso, a fim de aumentar a probabilidade de destruir todas as células vegetativas, aplicamos três tratamentos diferentes. A novidade e vantagens deste método é que os endosporos após o tratamento ainda estão intactas e podem ser utilizados para outras análises a jusante. Estes incluem a extração de DNA, PCR quantitativo (qPCR) e amplicon ou seqüenciamento metagenomic (visando especificamente o grupo de endospores e, assim, reduzindo diversity, enquanto o aumento da cobertura). Os endosporos também poderia ser utilizada para o cultivo ou a jusante quantificação por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, ou a detecção de DPA. Uma característica importante deste método é que, ao comparar uma amostra não tratada com uma amostra tratada, pode-se deduzir a quantidade e diversidade de endósporos em uma amostra ambiental, além do componente que corresponde a células vegetativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A resistência de endósporos a factores físico-químicos agressivos externos (por exemplo, temperatura ou detergentes) foi utilizado para conceber um método para separar os esporos bacterianos a partir de células vegetativas em amostras ambientais. Este é o primeiro método global para isolar os esporos a partir de amostras ambientais de uma maneira não destrutiva. Os métodos anteriores para quantificar, detectar e analisar os esporos foram em amostras com base na medição de proxies específicos para e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o Swiss National Science Foundation para Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e nº 151948, e Fundação Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
Referências
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