Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Les fibroblastes sont le type de cellules sécrétant principe responsable de la matrice extracellulaire et sont une composante essentielle de nombreux organes et tissus. Fibroblastes et la pathologie sous-tendent la physiologie un spectre d'entités cliniques, y compris les fibroses dans plusieurs organes, les cicatrices hypertrophiques brûlures suivantes, la perte de la fonction cardiaque après une ischémie, et la formation de stroma du cancer. Cependant, les fibroblastes restent un type mal caractérisé de la cellule, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. Les procédés existants pour l'isolement des fibroblastes en culture ont besoin de temps de cellule qui influence profondément phénotype et le comportement cellulaire. Par conséquent, de nombreuses études sur la biologie fibroblastes reposent sur la manipulation in vitro et ne reflètent pas fidèlement le comportement des fibroblastes in vivo. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un protocole à base de FACS pour l'isolement des fibroblastes de la peau du dos de souris adultes qui ne nécessite pas de culture cellulaire, ainsi preserving de la transcription physiologique et le profil protéomique de chaque cellule. Notre stratégie permet exclusion des lignées non-mésenchymateuses par une porte de lignée négative (Lin -) plutôt que d'une stratégie de sélection positive pour éviter de pré-sélection ou à l'enrichissement d'une sous-population de fibroblastes exprimant des marqueurs de surface spécifiques et être aussi inclusif que possible sur ce hétérogène type de cellule.
Introduction
Les fibroblastes sont souvent morphologiquement définies comme des cellules en forme de fuseau qui adhèrent à des substrats en matière plastique. Les fibroblastes sont le type cellulaire principe responsable de la synthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire dans des organes embryonnaires et adultes 1. Les fibroblastes sont donc cruciale pour le développement des mammifères et contribuent sensiblement au milieu extracellulaire qui influe sur le comportement des types présents dans chaque tissus et des organes de cellule voisine.
Les fibroblastes sont aussi le type de cellule principale derrière un ensemble diversifié de conditions médicales qui causent énorme fardeau clinique. L'activité des fibroblastes pathologique altère la fonction tissulaire normale et comporte des tissus et de la fibrose d'organes (tels que le poumon et le foie), la cicatrisation suivant la cicatrisation cutanée des plaies, l'athérosclérose, la sclérose systémique, et la formation de plaques d'athérome après une lésion de vaisseau sanguin 05/02. La cicatrisation des plaies, en particulier, à la fois aiguë et chronique, implique deposition de tissu cicatriciel que ni ressemble ni fonctions comme le tissu normal environnant, et conduit à une morbidité significative dans divers états pathologiques. À la suite de blessures, il existe une transition de fibroblastes de myofibroblastes, qui sécrètent des composants structuraux puis ECM, exercent des effets paracrines sur des types de cellules voisines, et rétablir la stabilité mécanique par dépôt de tissu cicatriciel 6.
Dans les tissus cutanés, il existe une variation significative de la qualité de la réparation des plaies à travers le temps de développement et entre les sites anatomiques. Dans les deux premiers trimestres de la vie du fœtus guérit sans laisser de cicatrices; Toutefois, à partir du troisième trimestre de la grossesse et de l'âge adulte, les humains guérir avec une cicatrice. Spécifique au site, en plus de la fonction de l'âge, les différences dans la cicatrisation des plaies existent. Les plaies dans la cavité buccale avec un minimum de remodeler la formation de cicatrices 7,8, tandis que le dépôt de tissu cicatriciel à l'intérieur de plaies cutanées 9 est significatif. La controverse persiste cONCERNANT l'influence relative de l'environnement par rapport aux propriétés intrinsèques des fibroblastes locaux sur les résultats de la cicatrisation des plaies en ce qui concerne à la fois l'âge et l'emplacement 10,11. Compte tenu des différences significatives dans la guérison des souris par voie orale contre derme cutanées et embryonnaire antérieure (E15) vs tard embryonnaire (E18) derme, il est probable qu'il existe des différences intrinsèques dans les populations de fibroblastes à certains âges de développement et parmi les différents sites anatomiques .
En 1986, Harold F. Dvorak posé tumeurs sont des plaies qui ne guérissent pas 12. Dvorak a conclu que les tumeurs se comportent comme des blessures dans le corps et induisent leur stroma par l'activation de la cicatrisation des plaies réponse de l'hôte. De nombreuses études ont depuis étudié la contribution des fibroblastes à la progression de carcinomes 13-15, mais comme dans le cas de la cicatrisation des plaies, l'identité et l'origine embryonnaire des fibroblastes qui contribuent au compartiment stromal cutanée de carcinomas n'a pas été suffisamment défini. La réponse à cette question porte pertinence médicale donnée études récentes exposant le fibroblaste associé à une tumeur comme une cible potentiellement efficace pour la thérapie anti-cancer 16.
Identifier et isoler de façon prospective les lignées de fibroblastes dotés d'un potentiel fibrogène in vivo est une étape essentielle vers manipuler efficacement leur réponse à une blessure dans un large éventail d'états pathologiques aigus et chroniques. En 1987, Cormack a démontré deux sous-populations de fibroblastes, un résidant dans la papillaire et un dans le derme réticulaire 17,18. Un troisième sous-population a été trouvée associée à follicules pileux dans la région de la papille dermique du follicule de 19,20. Lorsqu'elle est cultivée, ces différences sous-types de fibroblastes d'exposition dans le potentiel de croissance, la morphologie, et des facteurs de croissance / cytokines profils 21-24.
À ce jour, les études examinant fibroblastes ilterogeneity ont largement échoué à caractériser adéquatement la diversité de développement et fonctionnelle entre les fibroblastes in vivo. Ceci est, en partie, est le résultat d'une dépendance à l'égard des populations de fibroblastes en culture et l'effet d'homogénéisation de la culture cellulaire ou la sélection positive sur la base d'un récepteur de surface libre ne sont pas exprimés par les fibroblastes 25. Une étude récente de notre laboratoire a démontré un marqueur de surface profonde et changement de transcription dans les fibroblastes cultivés contre incultes isolés par la méthode d'isolation à base de FACS présenté dans ce manuscrit 26.
Par la suite, nous avons identifié une lignée de fibroblastes spécifique dans le derme dorsales murines et déterminé que cette lignée, défini par l'expression embryonnaire de Engrailed-1, est principalement responsable pour le dépôt de tissu conjonctif dans la peau du dos. Les fonctions de la lignée pendant deux formes aiguës et chroniques de la fibrose, notamment la cicatrisation, la formation de stroma du cancer, etrayonnement induit une fibrose 27. La caractérisation des lignées distinctes fibroblastes a des conséquences critiques pour les thérapies visant à moduler le comportement fibrogénique.
Plutôt que d'utiliser les protocoles existants qui reposent sur la manipulation in vitro pour obtenir l'isolement cellulaire 28,29, le protocole de récolte (Figure 1) détaillé ici aidera rendement analyses informatives de fibroblastes qui captureront plus exactement phénotype et le comportement in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit offre un moyen d'isoler les fibroblastes par tri à base de FACS, par rapport aux méthodes existantes, qui soit sélectionner une sous-population ou nécessitent du temps dans la culture cellulaire avant les analyses ultérieures. Le temps nécessaire à partir de la récolte de la peau pour le tri des fibroblastes est d'environ 6 h; toutefois, le nombre de souris utilisées dans la récolte aura une influence sur cette estimation.
Plusieurs po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par une subvention du NIH R01 GM087609 (à HPL), un cadeau d'Ingrid Lai et Bill Shu en l'honneur d'Anthony Shu (à HPL), subvention du NIH U01 HL099776 (MTL), le Laboratoire Hagey pour pédiatrique médecine régénérative et la Fondation Oak (MTL, GCG et HPL). GMV a été soutenu par l'École de médecine de Stanford, le Programme de formation scientifique médicale de Stanford, et la subvention de formation NIGMS GM07365. ZNM a été soutenu par la chirurgie plastique Research Foundation Fellowship Grant et le Fonds de la famille Hagey. MSH a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) la formation Fellow clinique de subvention TG2-01159, l'American Society of maxillo-chirurgiens (ASMS) / maxillo-faciale chirurgiens Foundation (MSF) Subvention de recherche, et de la transplantation et de génie tissulaire Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Referências
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