A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.
Escherichia coli sentezleme sistemi rekombinant ökariyotik proteinlerin üretimi için güçlü bir araçtır. Biz Shadoo prion familyasına ait bir proteini üretmek için kullanılır. Katma kütleleri tarif edildiği gibi (His) 6-etiketli rekombinant Shadoo saflaştırılması için bir kromatografik yöntem olarak ifade edilmiştir. Inklüzyon cisimcikleri, 8 M üre içinde çözülür ve iyon afinite kromatografisi gerçekleştirmek için bir Ni2 + -yüklü kolona bağlanmıştır. Bağlanmış proteinler imidazol gradyanı ile elüe edilir. Shadoo proteinini ihtiva eden fraksiyonlar bir yüksek ölçüde saflaştırılmış proteini elde etmek üzere boyut çıkarma kromatografisine tabi tutulur. Son adım saflaştırılmış Shadoo tuzlar, üre ve imidazol kaldırmak için HCl. Rekombinant Shadoo proteini prion hastalıklarda ortaya çıkan protein konformasyon bozukluklarının biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar için önemli bir reaktiftir. Birçok rapor prion nörodejeneratif hastalıklar bıçak birikimi kaynaklı olduğunu gösterdile, amiloid fibrilleri emretti. Asidik ve nötr olarak amiloid fibrilleri içine Shadoo fibrillate açıklayan örnek protokoller / temel pHs sunulmuştur. Üretilmesi ve bir hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde proteinin büyük miktarlarda üretilmesine imkan verir çünkü Shadoo, prion hastalıkları üzerinde çalışan laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir liflenme ile ilgili yöntemler.
İnsanlarda koyun ve Creutzfeldt-Jakob hastalığında sığır süngersi sığır ensefalopati, skrapisini dahil prion nörodejeneratif hastalıklar, ölümcül ve çaresiz. Prion hastalıkları esas olarak çapraz β-tabaka içine α-helisler oluşan hücresel prion proteininin konformasyonel değişiklikler ile karakterize edilen 1,2 konformer amiloid zenginleştirilmiş. Çapraz β-yapılar yoğun paketlenmiş içeren ve son derece düzenli kristal benzeri β-yaprak hidrojen bağları 3,4 ile stabilize. Prion amiloidleri işe bir şablon sağlamak ve bir monomerik protein birimi dönüştürme büyüyen kenarında β-ipliklerini nedeniyle kendini kopyalayan yapabilirsiniz.
"Protein sadece" hipotezine göre, prion proteininin amiloid konformer tek bulaşıcı ajandır. Bununla birlikte, başka bir biyomoleküllerin prion bozukluklarına gerekli olduğu önerilmiştir. Örneğin, hücre zarları, bir yer burada conversi olduğu düşünülmektediryer alır ve bazı negatif yüklü lipidler dönüştürme işlemi, 5,6 artırmak için gösterilmiştir. Buna ek olarak, bazı proteinler de prion patolojilerinde dahil olabilir. Doppel ve Shadoo 7,8: Spesifik olarak, prion proteini ailesinin iki diğer üyeleri vardır. Doppel di-sülfit köprüler ile stabilize nispeten rijit bir yapıya sahiptir ve Amiloid fibrillerin 9 kendi kendine polimerleşme ve agrega başarısız olur. Bunun aksine, prion proteinine benzer Shadoo amiloid fibril yapılarına bir β-tabaka zenginleştirilmiş bir yapı ve kendi kendine ilişkilendirmek alabilir. Bu Shadoo doğal koşullar altında, veya negatif yüklü membranlar 10,11 bağlanması üzerine liflenme denetlenebilir olduğu gösterilmiştir. Amiloid benzeri lif haline Shadoo dönüştürülmesi patolojileri ile ilişkili olabilir. Nitekim, amiloid benzeri yapılar hastalığa neden olan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.
Shadoo bir hidrofobik domain (HD) ve tandem Arg / Gly dizisi yer almaktadır içindeki t tekrarlarPrion proteininin (Şekil 1A) N-terminal parçası o. Prion proteininin N-terminal parçası olarak, Shadoo yüksek pozitif yüklü ve doğal olarak yapılandırılmamış bir protein 11,12 olduğu görünür. Doğrudan prion proteininin bağlanabildiği yana Shadoo prion bozukluklarına işlevsel olarak ilişkili gibi görünmektedir. Buna ek olarak, ifade aşağı prion patoloji 13,14 sırasında düzenlenir. Ancak, prion hastalığı Shadoo rolü henüz kurulmuş değildir.
Bu fare Shadoo geninin kodlama dizilimini taşıyan bir plazmit geliştirdi. Plasmid E. dönüştürmek için kullanılmış E. coli, N-terminal His 6 füzyon Shadoo proteinin üretimi için. Bu sentezleme sistemi de laboratuvarımızda kurulan ve yaygın devam eden projelerde 6,15,16 kullanılır. Shadoo ekspresyonu için önemli bir husus, E. seçimdir coli suşu. Yetkili BL21 bakteri suşu, rekombinant pro ekspresyonu için kullanılır ikenproteinlerinin Shadoo başarılı bir şekilde eksprese ve transforme SoluBL21 bakteri suşunun sadece saflaştırılmıştır. SoluBL21 yeterli E. E. coli ekspresyonu üst BL21 tespit edilebilir çözünebilir ürün elde proteinlerin üretimi için geliştirilmiş BL21 konak suşunun geliştirilmiş bir mutantıdır. SoluBL21 E. Shadoo yüksek düzeyde tanımlama E. coli katma kütlelerinin protein birikimine yol açar. Olmayan bir doğal proteinin, oldukça E. ifade edilir için genel bir özellik olarak, E. coli, bu protein, erimez içerik korları toplanma eğilimindedir. Shadoo muhtemelen farklı derecelerde katlanmış protein ile oluşturulan zenginleştirilmiş dinamik yapılara kovalent olmayan bir hidrofobik ya da iyonik etkileşimler (ya da her ikisinin bir kombinasyonu) ile toplanır. (I) denatürasyon ortamı içindeki diğer biyomoleküllerin proteinin bir seçici olarak ayrılması, ve (ii) saflaştırılmış proteinin bir renatürasyon in vitro katlanmasına kullanılarak: Sonuç olarak, en azından iki saflaştırma adımları içerirteknikleri.
Shadoo seçici ayrılması 8 M üre elde edilmiştir (ya da seçenek olarak 6M Guanidin-HCl) ihtiva eden bir tampon çözeltisi içinde sağlanmıştır. (I) renatürasyon bir asidik pH çözelti içinde polimerize edilmiş Shadoo elde etmek için pH ≥ eden bir çözeltiye, 7 bir yapısal olmayan monomerik Shadoo proteini, ya da (ii) renatürasyon elde etmek üzere üre uzaklaştırılması ve protein renatürasyon çeşitli protokoller uygulanarak yapılabilir Karakteristik çapraz β-yaprak motifleri ile istikrarlı amiloid liflerinin içine.
İfade ve rekombinant fare Shadoo proteininin büyük miktarda saflaştırılması hem de kolay ve etkin bir protokol verilmektedir. Anlatılan yöntem başarılı çözülmesini ve (O'nun 6) etiketli rekombinant Shadoo proteinin saflaştırılması verir. Başlığında belirttiği gibi bu, önemli bir prokaryotik bakterinin E. olarak ifade edildiğinde E. coli katma kütlelerinin Shadoo birikir. Shadoo arıtılmadan önce, bakteri Triton X-100 içeren bir tampon içinde sonifikasyon il…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Brémont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.
AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |