Effektiv pattedyrcelle Expression og Single-step Rensing av Ekstracellulær Glykoproteiner for Krystallisering
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Forstå proteinstruktur på et atomært nivå er nøkkelen til å avdekke molekylære grunnlaget for biologiske trasé og sykdommer. Røntgen-krystallografi protein er den mest brukte / anvendelig metode for å bestemme makromolekylære strukturer. Hovedutfordringen med denne metoden er å skaffe tilstrekkelige mengder av brettet skikkelig, ren protein. Dette blir et problem spesielt når du arbeider med utskilling av pattedyr proteiner, som gjennomgår bestemte post-translasjonelle modifikasjoner.
-Bakterielt uttrykte proteiner er den primære kilde til krystalliserte proteiner avsatt i Protein Data Bank 1. Bakterielle ekspresjonssystemer er i stor grad foretrukket fordi de er rask, billig og typisk produsere høye utbytter av protein. Imidlertid ekstracellulære domener av pattedyrproteiner uttrykt i bakterier, blir ofte ikke riktig foldet, i hvilket tilfelle refolding og omfattende rensetrinn er nødvendig for å oppnå homogent folded protein. I tillegg er mange pattedyrproteiner krever post-translasjonell glykosylering for å oppnå riktig folding 2. Selv om uttrykket og glykosylering i gjær eller insektceller kan overvinne folding problem, post-translasjonelle modifikasjoner, inkludert glykosylering, avviker betydelig fra de av pattedyrceller 3, noe som gir proteiner med feil eller ikke-homogene modifikasjoner.
Pattedyrceller uttrykke all den nødvendige molekylære maskineri for å sikre riktige posttranslasjonell modifikasjoner og folding; imidlertid disse ekspresjonssystemer vanligvis ikke foretrekkes av de fleste laboratorier, på grunn av begrensede avlinger og høye kostnader av reagenser og forbruksvarer. Polyethyleneimine (PEI), er en standard transfeksjon reagens relativt billig, men pålegger betydelig cytotoksisitet og lav transfeksjonseffektivitet, noe som resulterer i økte kostnader i celle media, DNA, og dyrking av utstyr. Mange alternativer til PEI er uoverkommelig dyrt. Vi henvenderdisse problemene ved å beskrive en kombinasjon av forbedrede cellekultur verktøy og kjemisk modifiserte PEI for rask og relativt billig fremgangsmåte for ekspresjon av utskilte pattedyrproteiner, etterfulgt av ett-trinns rensing. Denne robust metode gir tilstrekkelige utbytter av funksjonelle og biokjemiske studier 4, og i noen tilfeller resulterer i protein mottakelig for krystallisering uten ytterligere rensing.
Denne protokollen beskriver flere teknikker for å maksimere uttrykk og gi for utskilling av pattedyr proteiner i humane embryonale nyre (HEK) 293F celler dyrket i suspensjon. Transfeksjonseffektiviteten (og kostnader), proteinproduksjon og rensing er alle sterkt forbedret ved å følge denne protokoll. PEI modifisert ved tilsetning av karbamater gjennom en enkelt-trinns ringåpning reaksjon (PEI-TMC-25, syntese og egenskaper er beskrevet i detalj i ref 5) forbedrer transfeksjonseffektiviteten, reduserer cytotoksisitet fra kationiskemembran avbrudd og følgelig reduserer eksperiment kostnader. Videre er celleviabilitet og protein ekspresjon sterkt forbedret ved tilsetning av kultur kosttilskudd for å levere glukose og vitaminer. Viktigere for fremstilling av glykosylerte proteiner, behandling med kifunensine, et ikke-giftig kjemisk inhibitor av mannosidase I, produserer proteiner med definert, umodne glykaner, som kan fjernes ved endoglykosidase EndoHf for å gi proteiner med et enkelt N-acetylglukosamin i stedet for en full-lengde N-bundet glycan 6. Endelig tillater sekresjon av proteiner i et serum-fritt, kjemisk definert medium hurtig og lettvint rensing for strukturelle og biokjemiske studier. Ettrinns nikkel-nitriltrieddiksyre (Ni-NTA) harpiks rensing fjerner det meste av forurensende art i supernatanten og i noen tilfeller kan gi protein av tilstrekkelig renhet for krystallisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F-celler gir robust produksjon av proteiner som trenger post-translasjonelle modifikasjoner. Dette systemet tillater rask og skalerbar uttrykk for opprinnelig foldede proteiner inneholder disulfider, glykosylering og fosforylering som ellers ville være fraværende ved hjelp av flere rutinemessige uttrykk verktøy. I tillegg kan dette systemet bli anvendt for ekspresjon og rensing av multiproteinkomplekser bare ved ko-transfeksjon av flere plasmider. Foruten TREM2, har dette systemet vært mye brukt for funksjone…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Referências
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
