ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
הבנת מבנה חלבון ברמה אטומית היא מפתח לחשיפת הבסיס המולקולרי של מחלות ומסלולים ביולוגיים. קריסטלוגרפיה חלבון X-ray היא השיטה הנפוצה ביותר / ישימה לקביעת מבני macromolecular. האתגר העיקרי של שיטה זו הוא קבלת כמות מספקת של חלבון מקופל כראוי, טהור. זה הופך להיות בעיה במיוחד בעבודה עם חלבונים מופרשים יונקים, שעוברים לאחר translational שינויים ספציפיים.
חלבוני bacterially-הביעו הם המקור העיקרי של חלבונים התגבשו הופקדו בחלבון נתוני בנק 1. מערכות ביטוי חיידקים במידה רבה הם העדיפו כי הם מהירים, זולים ובדרך כלל לייצר תשואות גבוהות של חלבון. עם זאת, תחומים תאיים של חלבוני יונקים לידי ביטוי בחיידקים לעתים קרובות אינם מקופלים כראוי, שבו נדרשים צעדי מקרה refolding וטיהור נרחבת לקבלת הומוגנית FOחלבון lded. בנוסף, רבים חלבונים יונקים דורשים glycosylation לאחר translational להשיג קיפול נכון 2. למרות שהביטוי וglycosylation בתאי שמרים או חרק יכולים להתגבר על הבעיה מתקפלת, לאחר translational שינויים, כוללים glycosylation, שונים באופן משמעותי מאלה של תאי יונקים 3, מניב חלבונים עם שינויים לא נכונים או שאינם הומוגנית.
תאים יונקים להביע כל המכונות מולקולריות הנדרשות על מנת להבטיח שלאחר translational שינויים נכונים ומתקפל; עם זאת, מערכות ביטוי אלה אינן העדיפו בדרך כלל על ידי רוב המעבדות, בשל תשואות מוגבלות ועלויות גבוהות של חומרים כימיים וחומרים מתכלה. Polyethyleneimine (PEI), מגיב transfection סטנדרטי הוא זול יחסית, אך מטיל רעיל רבות ויעילות transfection נמוכה, וכתוצאה מכך העלויות מוגברות בתקשורת סלולארי, ה- DNA, וculturing ציוד. חלופות רבות לPEI הן יקרות. אנו פוניםנושאים אלה על ידי המתאר שילוב של כלים תרבית תאים השתפרו וששונה כימי PEI לשיטה מהירה וזולה יחסית לביטוי של חלבונים מופרשים יונקים, ואחריו טיהור בשלב יחיד. שיטה חזקה זה נותנת תשואות מספיקות ללימודים תפקודיים וביוכימיים 4, ובמקרים מסוימים, גורמת לחלבון ניתנים לגיבוש ללא טיהור נוספת.
פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות למקסם ביטוי ולהניב לחלבונים מופרשים יונקים באדם כליה עוברית (HEK) 293F תאים שגודלו בהשעיה. כל יעילות transfection (ועלות), ייצור חלבון וטיהור משופרת מאוד על ידי הבא בפרוטוקול זה. PEI שונה על ידי התוספת של carbamates באמצעות תגובת טבעת פתיחת שלב יחיד (PEI-TMC-25, סינתזה ותכונות מתוארות בפירוט בנ"צ 5) משפרים באופן משמעותי את יעילות transfection, מפחית את רעילה מקטיוניהפרעה קרום ולכן מקטינה את עלויות ניסוי. יתר על כן, כדאיות תא וביטוי חלבון הם השתפרו מאוד עם התוספת של תוספי התרבות לספק גלוקוז וויטמינים. חשוב לציין לייצור חלבונים מסוכרים, טיפול בkifunensine, מעכב כימי רעיל של Mannosidase אני, מייצר חלבונים עם, glycans בוגר מוגדר, אשר ניתן להסירו על ידי EndoHf endoglycosidase להניב חלבונים עם N-acetylglucosamine אחת במקום של באורך מלא N צמוד סוכרים 6. לבסוף, את ההפרשה של חלבונים לתוך מדיום סרום ללא, הגדרה כימית מאפשרת טיהור מהירה וקלילה ללימודים מבניים ביוכימיים. טיהור שרף חומצת ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נת"ע) בשלב יחיד מסירה את רוב זיהום מינים בsupernatant ו, במקרים מסוימים, יכול להניב חלבון של טוהר מספיק לגיבוש.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי HEK 293F מציעים ייצור חזק של חלבונים הדורשים שלאחר translational שינויים. מערכת זו מאפשרת ביטוי מהיר וניתן להרחבה של חלבונים מקופלים באופן מקורי המכילים disulfides, glycosylation, וזרחון שאחרת היה היעדר שימוש בכלים ביטוי שיגרתי יותר. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש לביטוי והטיהור של חלבון …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Referências
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
