Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
Los objetivos método descrito para analizar las concentraciones de corticosterona en las heces de equino con el fin de proporcionar una evaluación no invasiva de la actividad suprarrenal. La medición de la actividad (HPA) eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal es un método aceptado para estudiar la respuesta a situaciones potencialmente aversivas en ambas especies en cautividad y domésticas. La técnica de referencia y el método más ampliamente utilizado es el uso de plasma de la sangre 1 Sin embargo, los métodos alternativos tales como el análisis fecal se han desarrollado con el fin de superar el estrés inducido por el muestreo de sangre en sí y permitir la capacidad de seguimiento de las especies que van libres.
Durante una situación aversiva, la homeostasis fisiológica se altera. El hipotálamo en el cerebro libera hormona liberadora de corticotropina (CRH) que actúa sobre la glándula pituitaria anterior y estimula la liberación de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH). ACTH entra en el torrente sanguíneo y estimula la corteza adrenal para secretar especieS glucocorticoides específicos (GC). Los glucocorticoides están estrechamente vinculados a los acontecimientos estresantes en lugar de ser producido constantemente en todos los estados elevados de energía, por lo tanto a menudo se miden en preferencia sobre otras hormonas de estrés ligado 2. Los glucocorticoides son responsables de varios efectos adaptativos en caballos. La energía se movilizó rápidamente desde los lugares de almacenamiento en el cuerpo en forma de ácidos grasos y glucosa, el consumo de oxígeno se incrementa, la función sensorial se potencia 3 y el flujo sanguíneo se reduce a las zonas no necesarias para el movimiento 4. Además de actuar como mecanismo de defensa, el aumento inducido por el estrés de glucocorticoides también puede ayudar a preparar a los animales para el siguiente factor de estrés 5.
La evaluación de los niveles de hormonas en el plasma y saliva implica la medición de la hormona circulante actual, sin embargo, la medición de los metabolitos en las medidas de heces el producto final metabólico de la hormona. esteroides circulantes son catabolizados en el liver antes de su excreción en la bilis a la donde se someten a cambios adicionales facilitadas por las actividades enzimáticas de la flora bacteriana en el tracto intestinal 6. Por lo tanto, los inmunoensayos dirigidos a los glucocorticoides en la sangre no pueden ser adecuados para el análisis de los metabolitos de glucocorticoides fecales 7.
Como recogida fecal puede llevar a cabo sin perturbación para el caballo, el análisis de heces para la corticosterona, se ha utilizado ampliamente para controlar la actividad HPA en un número de circunstancias. Corticosterona elevada en las heces de los caballos ha sido reportada en respuesta a situaciones potencialmente aversivos incluso durante el tratamiento veterinario postoperatorio 8 y 9 en la vivienda restrictiva. Toma de muestras fecales refleja un nivel de glucocorticoides combinado con el tiempo en lugar de en el punto de muestreo en tiempo ofrecido por el plasma y la saliva por lo que es apropiado para el seguimiento a largo plazo, crónica o patrones estacionales 10. Debido a la no invasivanaturaleza del método, las muestras se pueden recoger en varias ocasiones para un individuo sin la necesidad para la captura o la restricción 11. Sin embargo, las especies de tiempo específico de tránsito intestinal se debe tener en cuenta al planificar un protocolo de muestreo. En los caballos, tiempo de tránsito intestinal es de alrededor de 18 hr 12, por lo tanto, la respuesta adrenal y posteriores metabolitos de corticosterona se pueden detectar en las heces un día después de la activación inicial del eje HPA.
Cuando se utilizan técnicas de inmunoensayo no invasivos una validación cuidadosa de la especie objeto de la investigación es esencial 13. Además, las diferencias de sexo en la hormona de excreción de los metabolitos se han reportado probablemente debido a las diferencias en la tasa metabólica y el tipo de metabolito excretado corticosterona en diversas especies, incluyendo ratones 14, 15 y pollos. Por ello es importante como parte de este método que el ensayo fue validado para su uso tanto en los caballos domésticos masculinos y femeninos como se detalla en la THprotocolo de correo. Esta diferencia en el metabolismo de las hormonas entre los géneros tiene consecuencias para la calidad de los datos, sin embargo, rara vez se aborda y se incluye como parte de la validación de un ensayo.
Este método no invasivo permite una evaluación a largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos domésticos. Los detalles del protocolo tanto en la validación del ensayo y de la técnica de ensayo en sí.
Protocol
Representative Results
Discussion
análisis corticosterona fecal proporciona un medio de evaluar los patrones de largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos. La naturaleza no invasiva del método supera los efectos de confusión de otros métodos de muestreo utilizados para evaluar la actividad suprarrenal incluyendo la saliva y el plasma análisis 9. Además, la técnica tiene una clara ventaja no invasivo si el estudio de los caballos que van libres.
Hay varios puntos clave para discutir con respecto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
Referências
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