Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Genoom-editing van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) biedt een genetisch gecontroleerd en klinisch relevante platform van waaruit de menselijke ontwikkeling te begrijpen en te onderzoeken de pathofysiologie van de ziekte. Door het gebruik van site-specific nucleasen (SSNs) voor het genoom bewerken, de snelle afleiding van nieuwe HPSC lijnen herbergen specifieke genetische veranderingen in een anders isogene instelling mogelijk wordt. Zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 zijn de meest gebruikte SSNs. Al deze nucleasen functioneren door het introduceren van een dubbelstrengs DNA pauze op een bepaalde site, waardoor precieze gen bewerken bevorderen op een genomische locus. SSN-mediteerde genoom bewerken exploiteert twee van endogene DNA-reparatie mechanismen van de cel, niet-homologe eind mee (NHEJ) en homologie gericht reparatie (HDR), ofwel te introduceren insertie / deletie mutaties of alter het genoom via homologe reparatie template op de plaats van de dubbelstrengs breuk. Elektroporatie van hPSCs is een efficiënt middel van het transfecteren SSNs en reparatie sjablonen die transgenen bevatten, zoals TL-reporters en antibioticaresistentie cassettes. Na elektroporatie, is het mogelijk om alleen die hPSCs dat de reparatie construct door de keuze van antibioticumresistentie isoleren. Mechanisch scheiden HPSC kolonies en bevestigt goede integratie op de doelplaats tot genotypering maakt de isolatie van juist gerichte en genetisch homogene cellijnen. De geldigheid van dit protocol wordt hier aangetoond met behulp van alle drie de SSN platforms op te nemen EGFP en een puromycineresistentie construct in de AAVS1 veilige haven locus in menselijke pluripotente stamcellen.
Genoom bewerken technologieën evolueren snel in standaard instrumenten voor moleculaire en celbiologie 1. Genetische manipulatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) is van bijzonder belang hPSCs vormen een zelfvernieuwende bron van genetisch intacte primaire humane cellen. hPSCs kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypes ziektemodel of als een bron voor transplantatie therapieën 2,3. Hier aangetoond is een protocol dat drie verschillende soorten van de site-specifieke nucleasen (SSNs) in combinatie met endogene DNA repair mechanismen voor gerichte integratie van een reporter construct bij de AAVS1 locus gebruikt. Na transfectie van SSNs in hPSCs, laten we zien hoe isogene celpopulaties te isoleren herbergen de verslaggever.
De mogelijkheid om het genoom te manipuleren, in het bijzonder pluripotente stamcellen genomen, met behulp van SSNs is geen nieuw fenomeen als het nut van zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activatof-achtige effector nucleasen (Talens) voor gen-editing werd enkele jaren geleden 4-10 aangetoond. Echter, met de komst van S. pyogenes CRISPR / Cas9 technologie 11-13, gen-editing is breed toegankelijke 14 geworden. Alle SSNs introduceren van een dubbelstrengs DNA break (DSB) op de opgegeven doellocatie 1,4,5,11 dat is gerepareerd door endogene cellulaire mechanismen met behulp van niet-homologe eind mee (NHEJ) of homologie gericht reparatie (HDR) 15. NHEJ is foutgevoelig en kan leesraam mutaties resulteert in verlies van genfunctie te voeren, terwijl de HDR maakt nieuwe elementen worden ingebracht door de co-transfectie van een reparatie sjabloon met de SSN. De fundamentele principes van DNA herstel dat gen bewerking te vergemakkelijken wordt gedacht dat grotendeels hetzelfde voor elke SSN zijn enkele verschillen tussen de platforms worden opgemerkt. De novo ontwerp ZFNs biedt flexibiliteit en nuclease optimalisatie 16, maar het gebruik van algemeenbeschikbaar montage bibliotheken en screening tools waarmee individuele ZFNs ontwerpen kan tijdrovend zijn. Zodra de gewenste locus voor ZFN-gemedieerde targeting wordt bepaald, kan ZFN paren worden ontworpen met de online tool ZiFit 17. Na het ontwerp, kan ZFNs modulair worden geassembleerd door verschillende rondes van plasmide klonen 18. Als alternatief zijn er vele in de handel verkrijgbaar, geprevalideerde ZFNs 19. VERHAAL nucleasen kan ook worden ontworpen met behulp van online tools en publiekelijk beschikbare componenten 17,20. Zo kan Talens snel worden samengesteld uit blokken van vijf herhalingen TALE door FLASH samenstel 21 of via PCR hiërarchische Golden Gate samenstel 22. Gemak van SSN ontwerp en de snelheid van de bouw met behulp van CRISPR / Cas9 hebben genoom maakte het bewerken van een breed toegankelijk tool. De korte gids-RNA gemedieerde targeting van CRISPR / Cas9 maakt het ook mogelijk voor het multiplexen van de gids RNA naar verschillende loci te richten met een enkel construct 14. Het ontwerpvan Cas9 voor gentherapie bewerking vereist slechts de identificatie van een protospacer aangrenzende motief (PAM, een NGG trinucleotide S. pyrogenes Cas9) proximaal aan het doel locus. Door het inbrengen van een oligonucleotide die overeenkomt met de 20 baseparen 5 'van de PAM in de px330 plasmide 14, kan het construct worden geassembleerd in een kloneringstap. Naast S. pyogenes Cas9, Cas9 van N. meningitidis (NmCas9) dat een 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) herkent is aangetoond om efficiënte gen-editing in hPSCs 23.
Naast de verschillen in gemak van SSN ontwerp, elk platform heeft specifieke eigenschappen. Bijvoorbeeld ZFNs en Talens gebruik maken van de FokI nuclease domein, dat vier nucleotide 5 'overhang 24 genereert terwijl Cas9 wordt gedacht dat vooral genereren stompe uiteinden DSB. ZFNs Talens en Cas9 verschillen in hun eiwitten stabiliteiten, on-off rate on target DNA en het soort DNA scannen, die cOuld theoretisch resulteren in kleine verschillen in de uitkomst bewerken 1. Terwijl verdere studies nodig zijn om de gevolgen van deze verschillen begrijpen beschrijven we hier een protocol dat is zeer robuust alle drie platforms en kan worden gebruikt om eenvoudig genereren van genetisch gemodificeerde hPSCs.
Ongeacht SSN keuze, elektroporatie is een deugdelijke procedure om SSNs en homologie reparatie sjablonen transfecteren in hPSCs 25. Het aantal overlevende kolonies na selectie van antibiotica resistentie afhankelijk locus-specifieke parameters en de bewerking strategie (bijvoorbeeld grootte van transgene insert en selectiemethode). De hier beschreven protocol resulteert gewoonlijk ongeveer 150-400 eencellige afgeleide kolonies.
Gene-bewerking op AAVS1 locus met dit protocol eerder is toegepast om de effectiviteit van SSNs 4,5 demonstreren. De AAV-CAGGS-EGFP reparatie sjabloon maakt gebruik van een gene trap strategie puromycine resistentie in een locus specifieke wijze. In het kort, de reparatie template bevat splice acceptor plaats stroomopwaarts van de promoter puromycineresistentie cassette. Bij juiste integratie in het eerste intron van het PPP1R12C gen op het AAVS1 locus, wordt de weerstand cassette uiting van promotor de bewerkte gen. De robuustheid van deze specifieke test AAVS1 kunnen wij de efficiëntie van elke SSN platform vergelijken.
Gene bewerken behulp SSNs krachtig gezien de mogelijkheid te verstoren en / of elk gen veranderen theoretisch. Toepassing van deze strategie hPSCs levert veelzijdigheid hPSCs vervolgens kan worden onderscheiden in een groot aantal humane cellen zoals neuronen 26 hepatocyten 27 pt 28 cardiomyocyten. Bovendien kan het gebruik van patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen maakt de reparatie of invoering van bekende ziekteverwekkende mutaties in een patiënt-specifieke genetische achtergrond 29 </sup>, Een platform van waaruit ziekte mechanismen en test geneeswijze met de eigen cellen van de patiënt 30 te onderzoeken. Samengevat, gen-editing in hPSCs is een efficiënte en veelzijdige aanpak van het onderzoek naar de fundamentele biologie van de menselijke ontwikkeling en de ziekte 31.
De hier gepresenteerde methode voor het isoleren van homogene populaties van gen aangepast humane pluripotente stamcellen is een krachtige aanpak voor het genereren HPSC isogene lijnen die alleen verschillen in de gerichte locus. Deze cellen vormen een ideaal systeem voor het sonderen van de mechanismen van menselijke cellulaire differentiatie en ontwikkeling en voor het begrip van de pathofysiologie van monogene aandoeningen in een gecontroleerde genetische omgeving. Zoals hier getoond, is het mogelijk om drie onafhankelijke SSN ontwerpstrategieën (ZFNs Talens en CRISPR / Cas9) gebruikt gerichte integratie op AAVS1 locus. Elk van deze methoden heeft zijn eigen voordelen en nadelen. Een potentieel voordeel van ZFNs en, tot op zekere hoogte Talens hun ontwerpflexibiliteit, die iteratieve techniek mogelijk maakt om de DNA bindende domeinen van individuele nucleasen 42 verbeteren. Deze nuclease optimalisatie kan de specificiteit van ZFNs en Talens dan wat haalbaar is met de CRI is te verhogenSPR / Cas9 systeem. Dergelijke selectiviteit kan belangrijk zijn voor klinische toepassingen die een hoge mate van doelwit specificiteit. Het belangrijkste voordeel van de CRISPR / Cas9 systeem is het gebruiksgemak. Hoewel TALEN en ZFN bouwpakketten beschikbaar zijn voor het publiek (dat wil zeggen, door middel van Addgene 21) gemaakt, CRISPR / Cas9 gebaseerde SSNs zijn aanzienlijk makkelijker te bouwen, als de enige noodzakelijke aanpassing is een 20 basenparen oligonucleotide (bij gebruik van de px330 plasmide ontwerp 14). Deze eenvoud blijkt voordelig voor onderzoekslaboratoria op zoek naar genoom bewerken in hun studies omvatten te zijn.
Er zijn alternatieve transfectie technieken, waaronder nucleofectie 43, to-gen aangepast HPSC lijnen te creëren; Maar elektroporatie is altijd constante en kosteneffectief 4,5,25 zijn. Nucleofectie kan worden gebruikt om direct te transfecteren Cas9-guide ribonucleoproteïne RNA-complexen in de kern, waardoor de efficiëntie van een SSNd fidelity 44. Groeiende hPSCs op MEF is een robuuste en goedkope methode om hPSCs in een pluripotente toestand te houden zonder al te veel differentiatie. Bovendien maakt de gemakkelijke isolatie van genetisch identieke kolonies. Als alternatief is het mogelijk om de cultuur hPSCs zonder MEFs, maar deze kweekomstandigheden kunnen duurder dan feeder gebaseerd culturen. Bovendien, het gehele proces is schaalbaar, waardoor de isolatie van zeldzame gebeurtenissen bewerken of het genereren van vele verschillende cellijnen parallel bewerken experimenten.
De hier beschreven protocol is robuust; maar er zijn een aantal belangrijke stappen die de efficiëntie waarmee juist bewerkte klonen worden verkregen beïnvloeden. De meest kritische component voor deze methode is met een hoge kwaliteit MEF en resistente DR4 MEF. Het voortbestaan van enkele hPSCs is vaag, en lage kwaliteit MEF zal de isolatie van ongedifferentieerde HPSC lijnen belemmeren. Ten tweede, het gebruik van Y-27632 ooksleutel tot enkele cel overleving mogelijk te maken zonder het opwekken van een selectieve druk op cellen met een abnormaal karyotype 45. Ten derde, het plukken goed gespreid koloniën zorgt genetische homogeniteit van de afgeleide cellijnen. Tenslotte is het belangrijk glazen pipetten bereiden zodat de opening klein genoeg is om de kolonie te breken in vele kleinere stukken, zodat meerdere kolonies groeien in de nieuwe put. Dit maakt het plukken van goed gespreid subklonen voor een replica plaat te hebben in de cultuur, het verlaten van de oorspronkelijke plaat van geïsoleerde kolonies voor genotypering. Een uitdagende rol in dit protocol is de handleiding te trekken van het glas pipetten; dit moet van tevoren worden beoefend. Opgemerkt zij dat er verschillende technieken van kloon picking die geen glazen pipet vereisen. Onderzoekers worden aangemoedigd om degene die het beste werkt voor hen te vinden.
Er zijn beperkingen aan dit protocol kunnen worden overwonnen door eenvoudige aanpassingen. Een experiment bedoeld om olleen verstoren de locus van belang zonder reparatie of degene wiens reparatie template niet een selectie cassette bevatten, moet een andere methode voor het verrijken van cellen die werden bewerkt gebruiken. Merk op dat het aantal kolonies die moeten worden opgehaald om een positieve kloon te sterk toe in afwezigheid van selectie. Een strategie om de efficiëntie te verbeteren is co-transfecteren van een niet-integrerende plasmide dat een fluorescerend eiwit tot expressie brengt. Nadat men de cellen herstellen gedurende twee dagen, gerichte cellen worden gesorteerd op de positieve fluorescentie met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering en opnieuw geplaat 29. Deze werkwijze verrijkt op cellen die zijn getransfecteerd met de plasmiden door elektroporatie en zodoende de kans op een gelijktijdige bewerking gebeurtenis in de cel.
De hier beschreven technieken kunnen worden uitgebreid naar meerdere guide RNAs om gelijktijdig richten verschillende loci 14,46,47. Veel protocollen zijn opgericht om hPSCs differentiërenin verschillende celtypen, waardoor verschillende genetische manipulaties in celtypen van belang 30. Kortom, hebben we de mogelijkheid van efficiënte genoom bewerking in hPSCs ongeacht SSN keuze gebleken. We stellen voor dat deze techniek kan worden aangepast om isogene HPSC lijnen die zijn gen-bewerkt op elk genoomplaats maken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02) Helen Bateup. Dirk Hockemeyer is een New Scholar in Aging van de Ellison Medical Foundation en wordt ondersteund door de Glenn Stichting alsmede de De Shurl en Kay Curci Foundation. DH wordt ook ondersteund door de NIH-subsidie 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |