El pez cebra como modelo para evaluar el potencial teratogénico de nitrito
Summary
La exposición a teratógenos puede causar defectos de nacimiento. El pez cebra son útiles para determinar el potencial teratogénico de productos químicos. Se demuestra la utilidad de pez cebra mediante la exposición de los embriones a diferentes niveles de nitrito y también en diferentes momentos de exposición. Se demuestra que el nitrito puede ser tóxico y causar graves defectos de desarrollo.
Abstract
Los altos niveles de nitrato en el medio ambiente pueden causar defectos congénitos o abortos involuntarios en los seres humanos. Presumiblemente, esto es debido a la conversión de nitrato a nitrito por las bacterias intestinales y salivales. Sin embargo, en otros estudios de mamíferos, los altos niveles de nitrito no causan defectos de nacimiento, aunque pueden conducir a resultados reproductivos pobres. Por lo tanto, el potencial teratogénico de nitrito no está claro. Sería útil disponer de un sistema modelo de vertebrados para evaluar fácilmente efectos teratogénicos de nitrito o cualquier otro producto químico de interés. Aquí, se demuestra la utilidad de pez cebra (Danio rerio) para detectar compuestos de toxicidad y defectos embrionarios. embriones de pez cebra son fertilizados externamente y tienen un desarrollo rápido, por lo que un buen modelo para los estudios teratogénicos. Se demuestra que el aumento del tiempo de exposición a nitrito afecta negativamente a la supervivencia. El aumento de la concentración de nitrito también afecta negativamente a la supervivencia, mientras que el nitrato no lo hace. Para tha embrionest sobrevivir a la exposición nitrito, varios defectos pueden ocurrir, incluyendo pericárdico y la yema de un edema salida, nadar noninflation vejiga, y la malformación craneofacial. Nuestros resultados indican que el pez cebra es un sistema conveniente para estudiar el potencial teratogénico de nitrito. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para probar otros productos químicos por sus efectos sobre el desarrollo de vertebrados temprano.
Introduction
Teratogénesis es un proceso que altera el desarrollo normal de un embrión o feto, causando anomalías estructurales y funcionales permanentes, retraso del crecimiento, o aborto involuntario en casos graves 1. Puede ser causada por ciertos agentes naturales (teratógenos), que interfieren con el desarrollo embrionario de múltiples maneras 2. Durante el desarrollo fetal humano, se han reportado teratógenos común, tales como la radiación, agentes infecciosos, metales tóxicos y productos químicos orgánicos para causar defectos en los pliegues epicánticos (el pliegue de piel en el párpado superior) y clinodactilia (dedo curvado o en el pie) a través de los errores morfogenéticos 1.
La comprensión del mecanismo molecular de teratogénesis es el primer paso hacia el desarrollo de tratamiento y prevención. Varios modelos de vertebrados tales como la rana de uñas africana (Xenopus laevis) y el pez cebra (Danio rerio) se han utilizado para determinar las vías moleculares afectadas por teratOgens. Estudios anteriores han utilizado el pez cebra como modelo para la epidemiología, toxicología y teratogénesis 3-7. Scholz et al. considerado el pez cebra como un "estándar de oro" para la evaluación de la toxicidad ambiental. Esto se debe, en parte, a la transparencia del embrión de pez cebra, que permite a los investigadores visualizar el defecto de desarrollo, ya que se produce 8. Aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen ortólogos en el pez cebra, por lo que el pez cebra un modelo vertebrado deseable para el estudio de los defectos humanos 9.
Algunos estudios epidemiológicos han sugerido que el nitrato y el nitrito, comúnmente presentes en los alimentos agrícolas y agua, están asociados con defectos de nacimiento y abortos espontáneos 10,11, mientras que otros estudios no apoyan esta asociación 12. El nitrato (NO 3 -) y nitrito (NO 2 -) están presentes de forma natural en el suelo y el agua. Ellos son una fuente de nitrógeno para las plantas y son una parte de la nciclo itrogen 13. Los alimentos como las judías verdes, zanahorias, calabaza, espinaca, remolacha y de las granjas que utilizan fertilizantes con alto contenido de nitrato han aumentado significativamente los niveles de nitrato y nitrito 7. La leche de vacas alimentadas con alimentos altos de nitratos y peces en agua de alta nitrato (principalmente de la salida del suelo 30) puede conducir a los seres humanos que consumen grandes cantidades de nitratos y nitritos 14. El nitrato y el nitrito también se utilizan comúnmente en la conservación de alimentos, lo que aumenta drásticamente la cantidad ingerida por los seres humanos 12.
Los niveles óptimos de nitrato y nitrito desempeñan papeles fundamentales en los procesos fisiológicos como la homeostasis vascular y la función, la neurotransmisión y los mecanismos de defensa del huésped inmunológicos 13-15. Sin embargo, la exposición a altos niveles de nitrato y nitrito puede dar lugar a efectos adversos, especialmente en lactantes y niños de 16. nitrato ingerido se convierte después en nitrito en la cavidad oral por la microflora y en THe tracto gastrointestinal por la microflora intestinal 17.
El nitrato pone bebés en un alto riesgo para el síndrome del bebé azul por la oxidación de la hemoglobina en metahemoglobina, deteriorando la hemoglobina de su capacidad de oxígeno 18 que lleva. Esto da como resultado el color azul de la piel que se extiende a los tejidos periféricos en los casos más graves. La oxigenación de los tejidos inhibido resultados en otros síntomas, más severa que conduce a coma y muerte 19,20. Síntomas similares se observan en los bebés y adultos en concentraciones más altas de nitrato de 21. Los niveles elevados de metahemoglobina en los adultos debido a los resultados de intoxicación de nitritos en la cianosis, dolor de cabeza, trastornos de la respiración 31, y la muerte si no se trata, debido a complicaciones relacionadas con la hipoxia tejido vital 32,33.
El nitrato ingerido en los niveles superiores también puede resultar en diversas complicaciones de salud. La diabetes infantil, la diarrea recurrente, e infecciones recurrentes del tracto respiratorioen los niños se han relacionado con una alta ingesta de nitrato de 11,17,22. La exposición crónica a un alto nivel de nitrato se asocia con la micción y la hemorragia del bazo. La exposición a altas dosis aguda de nitratos puede conducir a una amplia gama de condiciones médicas como dolor abdominal, debilidad muscular, sangre en las heces y la orina, desmayos, y la muerte 11. La exposición prenatal a nitrato en niveles altos se ha asociado con defectos del tubo neural y músculo-esquelético 11.
Un informe reciente mostró que el tratamiento con nitrito de embriones de pez cebra condujo a la yema edema salida, malformaciones craneofaciales y axial, y nadar noninflation vejiga 5. En este estudio, se demuestra un método para el tratamiento de embriones de pez cebra con nitrato y nitrito para determinar su potencial teratogénico. Los embriones fueron expuestos a nitrito a diferentes concentraciones y diferentes periodos de tiempo. El etanol se utiliza como un control positivo, ya que es un teratógeno establecido 23. Our método mostró que ambas altas concentraciones y tiempos de exposición largos a nitrito eran perjudiciales para la supervivencia y dieron lugar a diversos fenotipos, que van desde leve (edema) a graves defectos de desarrollo (brutos). Por lo tanto, el pez cebra es un modelo útil para explorar directamente los posibles efectos teratogénicos de nitrato y nitrito en embriones para complementar estudios epidemiológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método aquí descrito demuestra la utilidad de pez cebra para evaluar el potencial teratogénico de nitrito y nitrato. En comparación con otros vertebrados, el pez cebra tiene ventajas que incluyen alta fecundidad, la fertilización externa, transparencia óptica, y un rápido desarrollo. Mutantes disponibles que carecen de pigmentación (por ejemplo, el pez cebra Casper 36) también ayudan a mejorar la visibilidad de los órganos internos. También es fácil de generar pez cebra transgénico con genes i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.
Materials
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
Referências
- Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water–LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- . . Methods for chemical analysis of water and wastes. , (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
