Forbedring 2D og 3D Skin<em> In vitro</em> Modeller Brug Macromolecular Fortrængning
Summary
Vi præsenterer en protokol for at opnå celle-afledte matricer rige på ekstracellulære matrixproteiner, hjælp makromolekylære Crowders (MMC). Derudover præsenterer vi en protokol, som inkorporerer MMC i 3D organotypisk hud co-kultur generation, hvilket reducerer dyrkningstid samtidig opretholde løbetid på konstruktionen.
Abstract
Den glycoprotein familie af collagener repræsenterer de vigtigste strukturelle proteiner i den menneskelige krop, og er centrale elementer i biomaterialer, der anvendes i moderne tissue engineering. En teknisk flaskehals er aflejringen af collagen in vitro, som det er notorisk langsomt, hvilket resulterer i suboptimal dannelse af bindevæv og efterfølgende væv samhørighed, især i hudmodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der indebærer tilsætning af differentielt størrelse saccharose copolymerer i skindet kulturer til at generere makromolekylær fortrængning (MMC), hvilket resulterer i en dramatisk forøgelse af kollagen deposition. Især dermale fibroblaster deponeret en betydelig mængde af kollagen I / IV / VII og fibronectin under MMC sammenlignet med kontroller.
Protokollen beskriver også en fremgangsmåde til decellularize overfyldte cellelag, udsætter betydelige mængder af ekstracellulær matrix (ECM), som blev tilbageholdt på kulturen overflade som vist ved immunocytochemistry. Total matrix masse og fordelingsmønster blev undersøgt under anvendelse interferens refleksioner mikroskopi. Interessant fibroblaster, keratinocytter og co-kulturer fremstillet celleafledte matricer (CDM) af varierende sammensætning og morfologi. CDM kunne bruges som "bio-stilladser" for sekundær celle såning, hvor den nuværende anvendelse af belægninger eller stilladser, typisk fra xenogene animalske kilder, kan undgås, og dermed bevæger sig i retning af mere klinisk relevant applikationer.
Derudover denne protokol beskriver anvendelsen af MMC i den neddykkede fase af en 3D-organotypiske hud co-kultur model, som var tilstrækkelig til at forøge ECM aflejring i dermo-epidermal junction (DEJ), især kollagen VII, hovedkomponenten forankringsorganer fibriller. Elektronmikroskopi bekræftede tilstedeværelsen af forankring fibriller i kulturer udviklet med MMC, sammenlignet med kontroller. Dette er væsentligt, da forankringsorganer fibriller tether dermis til epidermis dermedhar en foruddannet modne DEJ kan drage fordel hudtransplantation modtagere i form af graft stabilitet og samlet sårheling. Endvidere blev dyrkningstid kondenseret fra 5 uger til 3 uger for at opnå en moden konstruktion, når der anvendes MMC, reducere omkostningerne.
Introduction
Huden danner en beskyttende barriere ved at forhindre vandtab og patogen post. Den består af tre hovedkomponenter; de stromale rige dermis 1, en stratificeret epidermis 2,3,4 på toppen af det, og dermo-epidermal junction i mellem 5,6. Dermis består hovedsageligt af kollagen og elastiske fibre og er tyndt befolket med fibroblaster 7. I modsætning hertil er den celle-rige epidermis består af flere lag af keratinocytter. Keratinocytterne af inderste lag er proliferativ og tilvejebringe nye basale celler, som fornyer og erstatte terminalt differentierende keratinocytter, der konstant flytter til den udvendige mest lag af huden og har mistet deres kerner og cytoplasmatiske materiale, hvilket resulterer i en forhornede lag, som undergår afskalning.
Den dermale-epidermale krydset, en specifik type basalmembran, er en kompleks struktur bestående af indbyrdes forbundne matrixmolekyler, der tethers epidermis til dermis. Kollagen I fibre af dermis interlace med kollagen VII forankring fibriller, som er forankret til collagen IV rige lamina densa. Forankring filamenter (laminin 5, collagen XVII og integriner) til gengæld forbinde lamina densa med hemidesmosomer af basale keratinocytter. Basale keratinocytter (stratum basale) har kapacitet til at formere sig og forny, samt differentiere og stratificere at danne suprabasallagene; stratum spinosum, stratum granulosum, og endelig stratum corneum, som repræsenterer kontakt overfladen af huden med miljøet. Undervejs fra det basale lag til forhornede lag, keratinocytter skifter ekspressionsmønstre for cytokeratiner og endelig undergår apoptose og indkapsle sig i forhornede kuverter, skrog specifikke proteiner, som er kovalent tværbundet ved transglutaminase aktivitet.
Genskabelse hud og dets lag in vitro, herunder de komplekse strukturer dermal-epidermal krydset og dermal ekstracellulære matrix, og at emulere cornificering proces, har længe fascineret forskere og bioengineers som en udfordrende opgave. Der har været betydelige fremskridt i huden tissue engineering, for eksempel, den vellykkede udvinding af hudceller fra patientens biopsier og generering af huden organotypiske kulturer ved hjælp patient-afledte hudceller 8. Dog forbliver uløste problemer vedrørende dårlig sekretion af ekstracellulære matrix proteiner ved hudceller selv og resulterer i sub-optimale hudmodeller. Desuden den nødvendige tid til at generere 3D organotypisk hud co-kultur ved hjælp af de nuværende protokoller varierer mellem fire til otte uger, en tidsramme, der potentielt kan afkortes med indarbejdelsen af makromolekylære Crowders. Reduktion kultur tid sparer reagens omkostninger, reducerer forekomsten af celle ældning og reducerer ventetiden for patienten skal produktet bruges i klinikken.
t "> Makromolekylær fortrængning (MMC) involverer om særlige makromolekyler til dyrkningsmediet at generere ekskluderede volumen effekter. Disse påvirker enzymatiske reaktionshastigheder herunder den proteolytiske spaltning af prokollagen, der er langsomme under standard vandige dyrkningsbetingelser 9-13. Under MMC, enzymatiske reaktioner er fremskyndet uden at øge mængden af reagenser 14,15 resulterer i, i tilfælde af prokollagen spaltning, en forøget mængde af kollagen i-molekyler i overfyldte kulturer i sammenligning med Uncrowded kontroller 10. da omdannelsen af procollagen til collagen tillader dannelsen af kollagen samlinger, fibroblaster dyrket med MMC i 48 timer gav signifikant mere kollagen i sammenlignet med Uncrowded fibroblastkulturer overvåges i op til fire uger 11,16,17. Udover virkninger på enzymatiske aktiviteter, som påvirker dannelsen, stabilisering og remodellering af ECM, MMC også har vist sig at direkte forbedre og modulere kollagenfiberdannelse 18,19.Vi præsenterer her en metode til at forbedre den ekstracellulære matrix (ECM) produktion af hudceller, navnlig dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter. Derudover viser vi, at den berigede ECM produceret under MMC i monolagskulturer kan decellulariserede og anvendt som rent celleafledt matrix (CDM).
Vi bruger en ikke-konventionelle tilgang til at visualisere og fuldt ud forstår ECM deponeret af hudceller dyrket med MMC. Interferens refleksioner mikroskopi anvendes typisk til at studere celle-matrix interaktioner eller celle-til-glas kontaktpunkter. Denne teknik blev anvendt i vores system til at se den samlede matrix aflejres på glasoverfladen. Interferens refleksioner mikroskopi blev koblet med fluorescerende immunfarvning for at opnå den mest mængden af information i form af ekstracellulær matrix komposition og mønster, i nærvær og fravær af MMC.
Organotypic hud co-kulturer er en klassisk metode til at modellere huden in vitro i en tredimensional kontekst. Mens todimensionale co-kulturer kan give væsentlige oplysninger, er det begrænset, når oversætte disse data og anvende det tilbage til et in vivo miljø, der er i sagens natur en tredimensionel struktur. Hud keratinocytter, i særdeleshed, er polariseret og indeholder apikale og basale segmenter, som er afgørende for homeostase og celle vedhæftning. Derudover er ekspressionen af typiske suprabasale proteiner i keratinocytter over det basale lag, såsom keratin 1, keratin 10 og filaggrin er kun til stede i løbet af lagdeling og terminal differentiering af keratinocytter. Som terminal differentiering er næppe til stede i typiske monolagskulturer er suprabasale proteinekspression normalt ikke nået i denne kultur-system. Derfor begynder organotypiske kulturer nedsænket i dyrkningsmediet, men derefter løftet til en luft-væske grænsefladen til at køre keratinocyte differentiering. Dette resulterer i ekspressionen af stratification markører, selv horndannelse og en generelt bedre afspejling af epidermal fysiologi. Mens andre grupper tidligere har genereret organotypisk hud co-kulturer med succes, har etableringen af en funktionel dermo-epidermal krydset zone været et problem. Her præsenteres en ny fremgangsmåde til dyrkning af organotypiske hud co-kulturer med en forbedret basalmembran, i sammentrængt tidsramme og uden at kompromittere modenhed af disse konstruktioner. Dette ville give huden mimetika til in vitro-modellering, studiet af huden biologi og et sortiment af screening-assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
Referências
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
