Améliorer 2D et 3D Skin<em> In vitro</em> Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

Summary

Nous présentons un protocole pour obtenir des matrices dérivées de cellules riches en protéines de la matrice extracellulaire, en utilisant Crowders macromoléculaires (MMC). En outre, nous présentons un protocole qui incorpore MMC dans organotypique génération de co-culture de la peau 3D, ce qui réduit le temps de la culture tout en maintenant la maturité de la construction.

Abstract

La famille des collagènes glycoprotéine représente les principales protéines structurales dans le corps humain, et sont des composants essentiels de biomatériaux utilisés dans l'ingénierie tissulaire moderne. Un goulot d' étranglement technique est le dépôt de collagène in vitro, comme il est notoirement lent, entraînant une sous-optimale la formation du tissu conjonctif et de la cohésion du tissu ultérieur, en particulier dans les modèles de peau. Ici, nous décrivons un procédé qui comprend l'addition de co-polymères de saccharose différentiellement taille des cultures de peau pour générer entassement macromoléculaire (CMM), qui se traduit par une amélioration spectaculaire du dépôt de collagène. En particulier, des fibroblastes dermiques déposé une quantité importante de collagène de type I / IV / VII et de la fibronectine sous MMC par rapport aux témoins.

Le protocole décrit également un procédé pour decellularize couches de cellules encombrées, exposant ainsi des quantités importantes de la matrice extracellulaire (ECM) qui ont été retenus sur la surface de culture comme en témoigne immunocytochemistry. motif total de masse et la distribution matrice a été étudiée en utilisant la microscopie interférence de réflexion. matrices intéressant, les fibroblastes, les kératinocytes et les co-cultures produites dérivées de cellules (MDP) de la composition et de la morphologie variable. MDP pourrait être utilisé comme «bio-échafauds» pour l'ensemencement des cellules secondaire, où l'utilisation actuelle des revêtements ou échafauds, généralement à partir de sources animales xénogéniques, peut être évité, déplaçant ainsi vers plus cliniquement pertinente des applications.

En outre, ce protocole décrit l'application de MMC pendant la phase immergée d'une peau modèle 3D organotypique co-culture qui était suffisant pour améliorer le dépôt de l'ECM dans la jonction dermo-épidermique (JDE), en particulier le collagène VII, le composant majeur des fibrilles d'ancrage. La microscopie électronique a confirmé la présence de fibrilles d'ancrage sur des cultures développées avec MMC, par rapport aux témoins. Cela est important car fibrilles d'ancrage d'attache du derme à l'épiderme, par conséquent,ayant une maturité DEJ préformé peut bénéficier receveurs de greffe de la peau en termes de stabilité du greffon et la guérison globale de la plaie. En outre, le temps de la culture a été condensé de 5 semaines à 3 semaines pour obtenir une construction mature, lorsque vous utilisez MMC, en réduisant les coûts.

Introduction

La peau forme une barrière protectrice en empêchant la perte d'eau et de l'entrée de l'agent pathogène. Il est constitué de trois composants principaux; les stromales riches derme ^1, un épiderme stratifié ^2,3,4 sur le dessus de celui – ci, et la jonction dermo-épidermique entre ^5,6. Le derme est composé en grande partie de collagène et des fibres élastiques et est peu peuplé avec des fibroblastes ^7. En revanche, l'épiderme riches en cellules est composé de plusieurs couches de kératinocytes. Les kératinocytes de la couche interne, la plupart sont proliférative et fournissent de nouvelles cellules basales qui renouvellent et remplacent les kératinocytes de différenciation terminale qui se déplacent constamment à la plus externe couche de la peau et ont perdu leurs noyaux et de matériel cytoplasmique, résultant en une couche cornée qui subit desquamation.

La jonction dermo-épidermique, un type spécifique de la membrane basale, est une structure complexe composée d'interconnexion molécules de la matrice, ce qui tethers l'épiderme au derme. fibres de collagène I du derme entrelacent avec le collagène VII fibrilles d'ancrage qui sont ancrés au collagène IV riche lamina densa. filaments d'ancrage (de la laminine 5, collagène XVII et intégrines) à son tour relient la lamina densa avec hémidesmosomes de kératinocytes basales. kératinocytes basales (stratum basale) ont la capacité de se multiplier et renouveler, ainsi que différencier et stratifier pour former les couches suprabasales; stratum spinosum, stratum granulosum, et enfin la couche cornée, qui représente la surface de la peau de contact avec l'environnement. En route à partir de la couche basale de la couche cornée, les kératinocytes passer les profils d'expression des cytokératines et enfin l'apoptose et s'enveloppent dans cornified des enveloppes, des coques de protéines spécifiques qui sont de manière covalente réticulés par activité transglutaminase.

Recréer la peau et de ses couches in vitro, y compris les structures complexes du jonction dermo-épidermique et dermique matrice extracellulaire, et d'imiter le processus de kératinisation, a les scientifiques et les bioingénieurs longtemps intrigué comme une tâche difficile. Il y a eu des avancées significatives dans la peau du génie tissulaire, par exemple, l'extraction réussie de cellules de la peau à partir de biopsies de patients et la génération de cultures organotypiques de la peau en utilisant des cellules de la peau des patients dérivés ^8. Cependant, les problèmes irrésolus restent relatifs à une mauvaise sécrétion des protéines de la matrice extracellulaire par les cellules de la peau et se traduit par des modèles sous-optimaux peau. En outre, le temps nécessaire pour générer la co-culture de la peau organotypique 3D en utilisant des protocoles actuels varie entre quatre à huit semaines, un délai qui pourrait éventuellement être raccourci avec l'incorporation de Crowders macromoléculaires. La réduction du temps de culture permet d'économiser le coût d'un réactif réduit l'incidence de la sénescence cellulaire et réduit le temps d'attente du patient, si le produit est utilisé en clinique.

t "> macromoléculaire entassement (MMC) consiste à introduire des macromolécules spécifiques au milieu de culture pour générer des effets de volume exclu. Ceux – ci affectent les taux de réaction enzymatique , y compris le clivage protéolytique de procollagène qui est en retard dans des conditions de culture aqueuses standards ^9-13. Sous MMC, les réactions enzymatiques sont empressa sans augmenter la quantité de réactifs ^14,15 entraînant, dans le cas du procollagène clivage, une plus grande quantité de collagène de molécules I dans des cultures encombrées par rapport aux témoins ¹⁰ uncrowded. comme la conversion du pro – collagène au collagène permet la formation de collagène assemblées, les fibroblastes cultivés avec MMC pendant 48 heures ont donné beaucoup plus de collagène I par rapport aux cultures de fibroblastes uncrowded surveillés jusqu'à quatre semaines ^11,16,17. outre les effets sur les activités enzymatiques qui affectent la formation, la stabilisation et le remodelage de l' ECM, MMC a également a été montré pour améliorer et moduler le collagène directementla formation de fibres ^18,19.

Nous présentons ici une méthode pour améliorer la production de la matrice extracellulaire (ECM) par des cellules de la peau, en particulier, les fibroblastes dermiques et de kératinocytes de l'épiderme. En outre, nous montrons que l'ECM enrichi produit dans MMC dans des cultures monocouches peut être décellularisé et utilisé comme matrice pur dérivé de cellules (MDP).

Nous utilisons une approche non-conventionnelle de visualiser et d'apprécier pleinement l'ECM déposé par les cellules de peau en culture avec MMC. La microscopie interférence de réflexion est généralement utilisée pour l'étude des interactions cellule-matrice ou points de contact de cellule à verre. Cette technique a été utilisée dans notre système pour afficher le montant total de la matrice déposée sur la surface du verre. La microscopie Interférence de réflexion a été couplé avec immunomarquage fluorescent pour obtenir la plus grande quantité d'informations en termes de composition de la matrice extracellulaire et la structure, en présence et en absence de MMC.

Organotypic peau co-cultures est une méthode classique pour modéliser la peau in vitro dans un contexte tridimensionnel. Alors que les co-cultures bidimensionnelles peuvent fournir des informations importantes, il est limité lors de la traduction de ces données et l' appliquer de nouveau à un environnement in vivo, ce qui est en soi une structure tridimensionnelle. kératinocytes de la peau, en particulier, sont polarisées et contiennent des segments apicales et basales qui sont essentielles pour l'homéostasie et l'adhérence des cellules. En outre, l'expression des protéines suprabasales typiques dans les kératinocytes au-dessus de la couche basale, telles que la kératine 1, de la kératine 10 et filaggrine est présent uniquement au cours de la stratification et la différenciation terminale des kératinocytes. La différenciation terminale est pratiquement présent dans des cultures monocouches typiques, l'expression de la protéine est normalement suprabasale pas réalisée dans ce système de culture. Par conséquent, les cultures organotypiques commencent immergés dans un milieu de culture, mais sont ensuite levées à une interface air-liquide pour conduire keratinocytdifférenciation e. Cela se traduit par l'expression des marqueurs de stratification, même la kératinisation et généralement une meilleure réflexion de la physiologie épidermique. Alors que d'autres groupes ont déjà généré la peau organotypique co-cultures avec succès, la mise en place d'une zone de jonction dermo-épidermique fonctionnelle a été un problème. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la culture de peau organotypique co-cultures avec une membrane basale améliorée, dans un laps de temps condensé et sans compromettre la maturité de ces constructions. Cela fournirait des mimétiques de la peau pour la modélisation in vitro, l'étude de la biologie de la peau et un assortiment de tests de criblage.

Protocol

1. macromoléculaire Surpeuplement en 2D des cultures de cellules de la peau Seed 50.000 cellules (fibroblastes primaires ou des kératinocytes primaires ou co-culture de fibroblastes et kératinocytes primaires) par puits d'une plaque de 24 puits. cellules de semences dans 1 ml de milieu de croissance de type cellule correspondante. Laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2. Jeter les anciens médias et le remplacer p…

Representative Results

Encombrement macromoléculaire a pu améliorer le dépôt d'ECM, en particulier, les fibroblastes déposés plus de collagène I, IV et de la fibronectine par rapport aux cultures témoins (Figure 1, la couche cellulaire; 1A, le collagène I; 1B, le collagène IV, 1C, fibronectine). Sur décellularisation, il était évident que les fibroblastes étaient les principaux déposants de collagène I, IV et de la fibronec…

Discussion

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks²⁰. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…

Materials

Ascorbic acid	Wako	013-12061	Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)	Greiner Bio-One	657610	Organotypic cultures
Citrate solution	Dako	S2369	DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)	Corning	354236	Organotypic cultures
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kit	Dako	K3468	Histology
Deep-well plate (6-well format)	Corning	355467	Organotypic cultures
ECL detection reagent	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM)	JEOL	JEM-1010 (100kV)	Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)			High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70	GE Healthcare Life Sciences	17-0310-05	Macromolecular crowder
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-0300-05	Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)	Life Technologies	17005-042	Cell culture media
Lysis buffer	ThermoFisher Scientific	89900	Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.
Microscope	Zeiss	LSM510	Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)	National Diagnostics	HS-106	Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)	ThermoFisher Scientific	8310-16	Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)	Sakura	4583	Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibiotics	Sigma Aldrich	A5955	Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibody	Abcam	#ab6308
Anti-Collagen Type IV	Novocastra	#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII			LH7.2 (in house)
Anti-Fibronectin antibody	Abcam	#ab2413
Reducing agent	ThermoFisher Scientific	NP0009	Western blot
Sample buffer	ThermoFisher Scientific	NP0008	Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-11037
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11001
Secondary antibodies (HRP)	Dako	Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse	undiluted
Sodium deoxycholate	Prodotti Chimicie Alimentari		Decellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4mg/mL hydrocortisone			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5mg/mL insulin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5mg/mL transferrin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Trypsin	Biopolis Shared Facilities	0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3	Used to trypsinize cells