أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة
Summary
في هذه المقالة وصفنا طريقة سهلة نسبيا تكييفها باستخدام صبغ مضان diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE) للأون كشف الوجه في وقت واحد وتصور أكسيد النيتريك داخل الخلايا (NO) وأنيون الفائق (O 2 .- ) على التوالي، في طازجة معزولة aortas سليمة من نموذج السمنة الماوس.
Abstract
المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من البطانية NO-سينسيز (أنوش) هي واحدة من الجزيئات vasoprotective الأكثر أهمية في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية. مختلة أنوش مثل فك ربط أنوش يؤدي إلى انخفاض في NO التوافر البيولوجي وزيادة في أنيون الفائق (O 2 .-) الإنتاج، وهذا بدوره يعزز أمراض القلب والأوعية الدموية. لذلك، قياس مناسب من NO و O 2 .- المستويات في الخلايا البطانية تقوم بدور محوري للأبحاث حول أمراض القلب والأوعية الدموية ومضاعفات. بسبب طبيعة عطوب للغاية من NO و O 2 .-، فإنه من الصعب قياس NO و O 2 .- مباشرة في الأوعية الدموية. وقد وضعت طرق عديدة لقياس NO و O 2 .- الإنتاج. غير أنه، إما غير مبال، أو غير محددة، أو يتطلب تقنية عالية ويتطلب معدات خاصة. نحن هنا وصف والتكيفمن طريقة مضان صبغ للأون كشف في وقت واحد وجه والتصور من الخلايا NO و O 2 .- باستخدام خلية قابلة للاختراق diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE)، على التوالي، في aortas سليمة من نموذج السمنة التي يسببها الماوس عن طريق تغذية عالية الدهون النظام الغذائي. نحن يمكن ان يظهر نقص الخلايا NO وتعزيز O 2 .- المستويات في aortas سليمة المعزولة حديثا من الماوس السمنة بالمقارنة مع السيطرة الماوس العجاف. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب هو أسلوب سهل للكشف المباشر والتصور من NO و O 2 .- في الأوعية الدموية سليمة، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع للتحقيق في (DYS) وظيفة بطانة الأوعية الدموية تحت (طبيب) الحالات المرضية.
Introduction
خلايا بطانة الأوعية الدموية الحفاظ على سلامة الوظيفية والهيكلية الأوعية الدموية عن طريق الإفراج عن عوامل فعال في الأوعية 1. ومن بين هذه العوامل، المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من L-أرجينين عبر البطانية NO-سينسيز (أنوش) هو العامل الأكثر أهمية وأفضل وصف في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية 2. لا يسبب استرخاء العضلات الملساء ويمنع تكاثر الخلايا، ويحول دون تراكم الصفائح الدموية والتصاق الخلايا الالتهابية والتسلل في الفضاء تحت البطانة، وبالتالي حماية ضد تطور أمراض الأوعية الدموية 3. في ظل العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك الشيخوخة، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري، وفرط شحميات الدم، وما إلى ذلك، الخلايا البطانية التي تتميز انخفض NO التوافر البيولوجي وزيادة O 2 .- الإنتاج الحالي ويعزز التسبب في تصلب الشرايين 2. وتبين دراسات من السنوات الأخيرة أن فك ربط أنوش هوآلية هامة لاختلال وظيفي البطانية، التي الإنزيم أنوش يولد O 2 .- بدلا من NO، تحت مختلف الظروف المذكورة أعلاه 1،4. لذلك، وتحليل وظيفة بطانة الأوعية الدموية، على وجه الخصوص، البطانية أي إنتاج وO 2 .- الجيل أمرا حيويا من أجل البحوث التجريبية على أمراض القلب والشرايين والمضاعفات.
هناك مقاربات منهجية العديدة التي تم تطويرها لتحليل وقياس أي إنتاج في العينات البيولوجية. ونظرا لطبيعة عطوب للغاية من NO الذي يتأكسد بسهولة إلى NO 2 – وNO 3 – وله عمر نصف من 3-6 ثانية، فإنه من الصعب قياس NO مباشرة. وقد استخدم في عينات السائل بمثابة مؤشر للNO صدر من الخلايا أو الأنسجة 5 – وبالتالي تحديد NO 2 – / NO 3. على الرغم من أن هذا الإجراء هو سهل نسبيا، فإن هذه الطريقة، ومع ذلك، عصامتتأثر SILY من خلفية عالية من NO مستقر 2 – / NO 3 – الواردة في الحل. لأنه لا يحفز ذوبان guanylate محلقة لإنتاج دوري غوانوزين الأدينوزين (المركب) 6، كما تم تحديد مستوى المركب الخلوي لتقدير NO إطلاق سراح 7. مرة أخرى، وهذا هو تقدير غير المباشر وقد لا تكون محددة، لأن بعض العوامل المشتقة من البطانة مثل C الببتيد الناتريوتريك نوع (CNP) ويمكن أيضا أن تعزز مستويات المركب من خلال تفعيل الجسيمات guanylate محلقة 8. لا يتم انتاجه من L-أرجينين مع جيل من L-سيترولين كناتج المنتج 9، قياس الإنتاج-L سيترولين ولذلك تستخدم أيضا طريقة غير مباشرة لتقدير أي إنتاج. العوائق الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها المشعة، وأنه لا قياس مستويات لا النشطة بيولوجيا، منذ صدر لا يمكن المعطل بسرعة عن طريق O 2 .-. وعلاوة على ذلك، L-سيترولين يمكن إعادة تدويرها إلى L-أرجينين 10. وتستخدم الطرق الكيميائية الأخرى مثل الكشف عن التوهج 11، والإلكترون تدور الرنين 12، أو porphyrinic الكهروكيميائية NO الاستشعار 13 عدد من الباحثين. وهذه الأساليب هي عادة ليست سهلة في التشغيل، وإجراءات الكشف وتتطلب معدات خاصة. بل هو أيضا الإشارة إلى أن العديد من الدراسات تنطبق التجارب حمام الجهاز مع الأوعية الدموية معزولة مع أو بدون البطانة لتقييم وظيفة بطانة الأوعية الدموية وغير مباشر قياس NO بوساطة الارخاء الأوعية الدموية المستمدة من البطانة. ومع ذلك، هذا الأسلوب، على الرغم من أنها في الغالب بالقرب الوضع الفسيولوجي، ولكن بدقة عن القول، لا قياس أي وظيفة، فإنه بدلا يقيم الردود حركي بوساطة البطانة بشكل عام التي تعكس آثار صافية قدرها وظيفة أنوش، وإنتاج البعض الاسترخاء المستمدة من البطانة العوامل وعوامل التعاقد المستمدة من البطانة، وإنتاج O 2 .-، وأيضا ردود خلايا العضلات الملساءلهذه العوامل. مطلوب تحليل معين من وظيفة أنوش أو أي إنتاج عادة 3.
العديد من المجموعات البحثية بما في بلدنا في السنوات الأخيرة استخدام أسلوب صبغ مضان للكشف عن إنتاج الخلايا من NO 14-19. في هذه الطريقة كانت تستخدم الخلية مؤشر مضان نفاذية diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) لقياس حرة لا وظيفة NOS في الخلايا والأنسجة في المختبر أو خارج الجسم الحي. وأنه في الخلايا الحية، وdeacetylated مبدأ DAF-2DA بواسطة استريز داخل الخلايا لغير الفلورسنت 4،5-diaminofluorescein (DAF-2) الذي تم تحويلها بعد ذلك إلى فلوري DAF-2 التريازول (DAF-2T) عن طريق تفاعل مع NO . مضان من DAF-2T يمكن ملاحظتها تحت المجهر مضان أو مضان المجهر متحد البؤر 14. ولذلك يبين كثافة مضان داخل الخلايا لإنتاج NO الخلايا في الخلايا أو البطانة لفي حالها vesse الدمل. جنبا إلى جنب مع صبغ مضان محددة مثل dihydroethidium (DHE)، ويمكن للمرء أن يقيم في وقت واحد داخل الخلايا NO و O 2 .- جيل في الخلايا أو في الأوعية الدموية 14. وبالمثل، DHE هو أيضا مركب خلية نفاذية أن يتأكسد بواسطة O 2 .- داخل الخلايا، والمنتج الأكسدة ثم intercalates مع الأحماض النووية لتنبعث منها اللون الأحمر الفاتح اكتشاف كميا بواسطة المجهر الفلورسنت أو مضان المجهر متحد البؤر. DHE هو صبغة محددة للغاية للكشف عن O 2 .- من العينات البيولوجية، كما يكشف أساسا هذه الجزيئات، يتم الاحتفاظ بشكل جيد من قبل الخلايا، بل ويمكن أن يتسامح مع تثبيت خفيف 20. واحدة من مزايا هذه الطريقة مضان صبغ هو أنه يكشف ويتصور NO و / أو O 2 .- أون الوجه مباشرة على الطبقة البطانية سليمة من أحد الأوعية الدموية المعيشة.
في هذه الورقة،وصفنا هذه الطريقة مضان صبغ للكشف NO و O 2 .- التي تكيفنا لأون كشف الوجه من NO و O 2 .- في aortas سليمة لنموذج الفأر السمنة الناجمة عن ارتفاع الدهون النظام الغذائي التغذية (HFD). علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يمكن بنجاح وبشكل موثوق قياس NO و O 2 .- المستويات وتقييم أنوش وظيفة (DYS) في الطبقة البطانية المعزولة حديثا aortas الماوس سليمة في السمنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كشف NO أو O 2 .- مع الأصباغ الفلورية وكثيرا ما تستخدم في العديد من الدراسات في الخلايا البطانية مثقف وأيضا في cryosections الأنسجة 23. نحن هنا تمديد هذه الطريقة إلى الأوعية الدموية المعيشة على حالها، أي أون كشف الوجه من NO و O 2 .- المستو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
Referências
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
