절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험
Summary
우리는 분리, 표현형 특성화 및 쥐의 잇몸에서 면역 세포의 기능 분석을위한 기술을 설립했다.
Abstract
Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.
Introduction
치은 조직은 인간 및 뮤린 치열을 둘러싸고 끊임없이 티스 (1)의 복잡한 생물막에 노출된다. 치은 배리어 치안 면역 세포 망은 병원성이 챌린지에 대한 효과적인 면역성을 제공하는 동시에, 조직의 무결성을 유지하는 로컬 공생 미생물과 항상성을 보장하고 필수적이다. 항상성을 달성하기 위해, 면역 시스템은 신중 아직 작은 디테일이 치은 면역 세포군 및 조직 내성 (2)를 유지하는 역할로 알려진 고도로 전문화 면역 세포 망을 생성 치은 환경에 맞게 조정된다.
면역 항상성이 치은에 중단되면, 어느 증가 호스트 감수성 및 / 또는 dysbiotic 미생물 지역 사회, 염증 상태의 존재를 통해, 치주염 3 (4)를 발생한다. 치주염은 치아의 손실로 이어지는 일반적인 염증성 질환입니다upporting 구조. 그것의 심한 형태는 일반 인구 (5)의 약 10 %에서 볼 수있다. 치주염 감수성과 진행에 관여하는 중요한 요소를 해부하는 것은 6 어려운 입증했다. 그러나, 동물 모델은 치주염 개시 및 진행 (7)의 메커니즘을 이해하는데 매우 유용 하였다. 모델 면역 항상성 및 치주염의 구동 발전을 유지하는데 필수적인 주요 세포 집단과 분자 매개체를 정의하는데 이용 될 수있다. 이러한 통찰력은 면역 항상성의 치은 특정 제어에 대한 우리의 이해를 변환 및 질환 발병의 우리의 현재 이해를 촉진 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 기술이 성공적으로 적합한 (단일 마우스)에서 면역 세포의 수가 산출뿐만 아니라 표현형 특성화뿐만 아니라 기능적 연구 생체. 다른 그룹은 이전에 분리하여 치은 뮤린 면역 세포를 특성화하는 프로토콜 번역 및 동물 모델 9 치주염의 연구에서 유세포 빛깔의 사용 가치를 도입했다. 상당한 문제 해결이 프로토콜의 주요 수정을 따르면 치은 칼라 영역과 치간 치은 (그?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.
Materials
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3mL |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 mL FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
Referências
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., & Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., & Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I. Et Al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., & Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., & Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology / Edited By John E. Coligan … [Et Al.]. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M. Et Al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M. Et Al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229ra240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., & Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
