Entwicklung Methode Regie in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae bietet viele attraktive Vorteile , wenn Enzyme für biotechnologische Anwendungen entwerfen, ein Prozess, der Konstruktion, Klonierung und Expression von mutanten Bibliotheken, die mit Hochfrequenz – homologe DNA – Rekombination in vivo beinhaltet. Hier stellen wir ein Protokoll zu erstellen und Bildschirmmutantenbibliotheken in Hefe am Beispiel eines Pilz Aryl-Alkohol-Oxidase (AAO) seine Gesamtaktivität zu verbessern. Zwei Proteinsegmente wurden einer fokussierten gerichteten Evolution durch zufällige Mutagenese und de – vivo – DNA – Rekombination. Auskragungen von ~ 50 bp jedes Segment flankieren, erlaubt die korrekte Zusammenbau der AAO-Fusionsgens in linearisierter Vektor zu einem vollen autonom replizierenden Plasmid führt. Mutant Bibliotheken angereichert mit funktionellen AAO – Varianten wurden in S. gescreent cerevisiae Überstand mit einem empfindlichen Assay mit hohem Durchsatz auf die Fenton – Reaktion basiert. Der allgemeine Prozess derBibliothekskonstruktion in S. cerevisiae beschrieben hier leicht zu entwickeln viele andere eukaryotischen Genen angewandt werden, die Vermeidung zusätzliche PCR – Reaktionen, in vitro – DNA – Rekombination und Ligatur Schritte.

Introduction

Regie molekulare Evolution ist eine robuste, schnelle und zuverlässige Methode zu entwerfen Enzyme ^{1, 2.} Durch iterative Runden zufällige Mutation, Rekombination und Screening, verbesserte Versionen von Enzymen erzeugt werden können , die auf neue Substrate wirken, in neuartigen Reaktionen, in nicht-natürliche Umgebungen oder sogar um die Zelle zu unterstützen neue metabolische Ziele ^3-5 zu erreichen. Unter den Wirten in der gerichteten Evolution verwendet, um die Hefe Saccharomyces cerevisiae Brau bietet ein Repertoire an Lösungen für die funktionelle Expression von komplexen eukaryotischen Proteine ​​, die ^6,7 in den prokaryotischen sonst nicht verfügbar sind.

Verwendet erschöpfend in der Biologie Studien Zelle dieses kleine eukaryotischen Modell hat viele Vorteile in Bezug auf die post-translationale Modifikationen, die einfache Handhabung und Transformationseffizienz, von denen alle wichtigen Merkmale sind Enzyme zu konstruieren , durch gerichtete Evolution ^8. Darüber hinaus ist die Hochfrequenzvon homologen DNA – Rekombination in S. cerevisiae gekoppelt seiner effizienten proof-Lesevorrichtung eröffnet eine breite Palette von Möglichkeiten für die Bibliothekserstellung und Genanordnung in vivo, um die Entwicklung der verschiedenen Systeme von einzelnen Enzymen zur komplexen künstlichen Wege ^9-12 fördern. Unser Labor hat die letzten zehn Jahre verbrachte Tools und Strategien für die molekulare Evolution verschiedener Ligninasen in Hefe (Oxidoreduktasen beteiligt in den Abbau von Lignin während der natürlichen Holzzersetzung) ^13-14 entwerfen. In dieser Mitteilung stellen wir ein detailliertes Protokoll und Bildschirm Mutantenbibliotheken in S. vorzubereiten cerevisiae für ein Modell flavooxidase, Aryl-Alkohol – Oxidase (AAO ¹⁵⁾ -, die leicht auf viele andere Enzyme , übersetzt werden können. Das Protokoll beinhaltet eine fokussierte gerichtete Evolution – Methode (MORPHING: mutagene Organized Rekombinationsprozeß durch homologe de vivo – Gruppierung) von der Hefezelle Gerät ¹⁶ unterstützt wird , einda sehr empfindlich Screening – Test auf der Grundlage der Fenton – Reaktion , um AAO – Aktivität nachzuweisen in der Kulturbrühe sezerniert ^17.

Protocol

1. Mutant Library Construction Wählen Sie die Regionen unterworfen werden mit Hilfe von Computer – Algorithmen auf MORPHING basierend auf den verfügbaren Kristallstruktur oder Homologie – Modelle 18. Dabei zielen zwei Regionen AAO aus Pleurotus für zufällige Mutagenese und Rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), während Amplifizieren der Rest des Gens (844 bp) von High-Fidelity – PCR (Abbildung 1). Hinweis: Mehrere Segmente k…

Representative Results

AAO von P. eryngii ist eine extrazelluläre flavooxidase die Pilz-Peroxidasen mit H 2 O 2 liefert Lignin zu starten angreifen. Zwei Segmente der AAO wurden fokussierte gerichtete Evolution unterworfen , indem MORPHING, um ihre Aktivität und ihre Expression zu verstärken in S. cerevisiae 19. Unabhängig von den ausländischen von S. beherbergte Enzyme cerevisiae, die kritischste Problem , wenn Mutantenbibliotheken in H…

Discussion

In diesem Artikel haben wir die meisten der Tipps und Tricks beschäftigt in unserem Labor zu konstruieren Enzyme durch gerichtete Evolution in S. zusammengefasst cerevisiae (unter Verwendung AAO als Beispiel) , so dass sie für die Verwendung mit vielen anderen eukaryotischen Enzymsysteme durch einfaches Folgenden werden die allgemeinen hier beschriebenen Ansatz angepasst werden kann.

In Bezug auf die Bibliothek Schöpfung ist MORPHING eine schnelle Ein-Topf – Verfahren ei…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)