توجه طريقة تطور في<em> خميرة الخباز</em>: المسخ مكتبة الخلق والفرز
Summary
We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.
Introduction
التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات 1، 2، ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة 3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة 6،7.
تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه 8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة 9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) 13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO 15) -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة 16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو مو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].
Materials
| 1. Culture media | |||
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39 |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13 |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51 |
| Peptone | Difco | 211677 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09 |
| Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
| Yeast Extract | Difco | 212750 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids | Difco | 291940 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. PCR Reactions | |||
| dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM each |
| iProof High-Fidelity DNA polymerase | Bio-rad | 172-5301 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
| Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D4545 | For error prone PCR |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Plasmid linearization | |||
| BamHI restriction enzyme | New England Biolabs | R0136S | |
| Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001S | |
| XhoI restriction enzyme | New England Biolabs | R0146S | |
| Gel Red | Biotium | 41003 | For staining DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4. FOX assays | |||
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14 |
| Anysil Alcohol | Sigma Aldrich | W209902 | CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16 |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17 |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX standard curve |
| Xylenol Orange disodium salt | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62 |
| Agarose gel stuff | – | – | – |
| Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
| Gel Red | Biotium | 41003 | DNA analysis dye |
| GeneRuler 1Kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA M.W. standard |
| Loading Dye 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
| Low-melting temperature agarose | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5. Kits and cells | |||
| S. cerevisiae strain BJ5465 | LGC Promochem, Spain | ATTC 208289 | Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
| E. coli XL2-Blue competent cells | Agilent genomics | 200150 | For plasmid purification and amplification |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740,609,250 | DNA gel extraction |
| NucleoSpin Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Column miniprep Kit |
| Yeast Transformation Kit | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Included DNA carrier (Salmon testes) |
| Zymoprep yeast plasmid miniprep I | Zymo research | D2001 | Plasmid extraction from yeast |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6. Plates | |||
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655101 | Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements) |
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655161 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
| 96-well plate lid | Greioner Bio-One | 656171 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
Referências
- Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
- Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
- Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
- Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
- Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
- Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
- Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
- Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
- Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
- Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
- Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).
- Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
- Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
- Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
- Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
- Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
- Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .
- Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).
