We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.
Evolutie in Saccharomyces cerevisiae biedt vele aantrekkelijke voordelen bij het ontwerpen van enzymen voor biotechnologische toepassingen, een proces dat de constructie, klonering en expressie van mutante bibliotheken, gekoppeld met hoge frequentie homologe DNA recombinatie in vivo omvat. Hier presenteren we een protocol en het scherm mutante bibliotheken in gist hand van het voorbeeld van een schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) om haar totale activiteit verhogen creëren. Twee eiwitsegmenten werden onderworpen aan gerichte gerichte evolutie door willekeurige mutagenese en DNA in vivo recombinatie. Overhangen ~ 50 bp flankerend elk segment kon de juiste montage van de AAO-fusiegen in een gelineariseerde vector waardoor een volledig autonoom replicerend plasmide. Mutant bibliotheken verrijkt met functionele AAO varianten werden vertoond in S. cerevisiae supernatanten met een gevoelige high-throughput assay gebaseerd op de Fenton reactie. Het algemene proces vanbibliotheek bouw in S. cerevisiae beschreven kunnen gemakkelijk worden toegepast op vele andere eukaryote genen evolueren vermijden extra PCR reacties, in vitro DNA recombinatie en ligatiestappen.
Gerichte moleculaire evolutie is een robuuste, snelle en betrouwbare methode om enzymen ontwerpen 1, 2. Door iteratieve ronden van willekeurige mutatie, recombinatie en screening, verbeterde versies van enzymen kan worden gegenereerd die inwerken op nieuwe substraten in nieuwe reacties, in niet-natuurlijke omgevingen of zelfs de cel te helpen nieuwe metabole doelen 3-5 bereiken. Onder de gastheren gebruikt in gerichte evolutie, van de brouwer gist Saccharomyces cerevisiae heeft een repertoire van oplossingen voor de functionele expressie van complexe eukaryote eiwitten die anders niet beschikbaar in prokaryotische tegenhangers 6,7 zijn.
Uitvoerig gebruikt in celbiologische Dit kleine eukaryotische model heeft vele voordelen in termen van posttranslationele modificaties, gemakkelijke manipulatie en transformatie-efficiëntie, die allemaal belangrijke eigenschappen om enzymen te construeren door gerichte evolutie 8. Bovendien is de hoogfrequentevan homologe DNA recombinatie in S. cerevisiae gekoppeld aan een efficiënte proof-leesapparaat opent een breed scala aan mogelijkheden voor de bibliotheek creatie en gen-assemblage in vivo, het bevorderen van de ontwikkeling van verschillende systemen van enkele enzymen om complexe kunstmatige paden 9-12. Ons laboratorium heeft de afgelopen tien jaar van het ontwerp gereedschappen en strategieën voor de moleculaire evolutie van verschillende ligninasen in gist (oxidoreductases betrokken bij de afbraak van lignine in het hout verval) 13-14. In deze mededeling, presenteren we een gedetailleerd protocol voor te bereiden en het scherm mutant bibliotheken in S. cerevisiae een model flavooxidase, -aryl-alcohol oxidase (AAO 15) -, welke gemakkelijk vertalen vele andere enzymen. Het protocol gaat om een gerichte-evolutie methode (MORPHING: Mutageen Organized Recombinatie Process door homologe de vivo Groepering) bijgestaan door het gistcel apparaat 16, eenda zeer gevoelige screening assay gebaseerd op de Fenton reactie om AAO activiteit afgescheiden in het kweekmedium 17 te detecteren.
In dit artikel hebben we samengevat het grootste deel van de tips en trucs die werkzaam zijn in ons laboratorium om enzymen ingenieur door gerichte evolutie in S. cerevisiae (met AAO ter illustratie) zodat ze kunnen worden aangepast voor gebruik met vele andere eukaryote enzymsystemen door simpelweg na de gemeenschappelijke benadering beschreven.
Qua bibliotheek schepping MORPHING is een snel-pot methode te introduceren en recombineren willekeurige mutaties in kleine stukjes eiwit t…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].
1. Culture media | |||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39 |
Bacto Agar | Difco | 214010 | |
Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13 |
D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16 |
D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51 |
Peptone | Difco | 211677 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09 |
Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
Yeast Extract | Difco | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids | Difco | 291940 | |
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. PCR Reactions | |||
dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM each |
iProof High-Fidelity DNA polymerase | Bio-rad | 172-5301 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D4545 | For error prone PCR |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Plasmid linearization | |||
BamHI restriction enzyme | New England Biolabs | R0136S | |
Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001S | |
XhoI restriction enzyme | New England Biolabs | R0146S | |
Gel Red | Biotium | 41003 | For staining DNA |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4. FOX assays | |||
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14 |
Anysil Alcohol | Sigma Aldrich | W209902 | CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16 |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17 |
Hydrogen peroxide 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX standard curve |
Xylenol Orange disodium salt | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62 |
Agarose gel stuff | – | – | – |
Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
Gel Red | Biotium | 41003 | DNA analysis dye |
GeneRuler 1Kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA M.W. standard |
Loading Dye 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
Low-melting temperature agarose | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5. Kits and cells | |||
S. cerevisiae strain BJ5465 | LGC Promochem, Spain | ATTC 208289 | Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
E. coli XL2-Blue competent cells | Agilent genomics | 200150 | For plasmid purification and amplification |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740,609,250 | DNA gel extraction |
NucleoSpin Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Column miniprep Kit |
Yeast Transformation Kit | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Included DNA carrier (Salmon testes) |
Zymoprep yeast plasmid miniprep I | Zymo research | D2001 | Plasmid extraction from yeast |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6. Plates | |||
96-well plates | Greioner Bio-One | 655101 | Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements) |
96-well plates | Greioner Bio-One | 655161 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
96-well plate lid | Greioner Bio-One | 656171 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |