Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
condução do nervo eficiente no sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) requer a mielinização dos axónios por oligodendrócitos. Durante o desenvolvimento, oligodendrócitos surgem a partir de um conjunto de células progenitoras de oligodendrócito (OPCs) que estão pensados para migrar das zonas do ventrículo do cérebro anterior e do tubo neural em desenvolvimento 1. Depois de OPCs migração diferenciar em oligodendrócitos, maduros myelinating que não só facilitar a propagação do impulso eficiente, mas também fornecer axônios com suporte trófico 2. O adulto CNS mantém uma população abundante de OPCs que estão dispersos em toda a matéria cinzenta e branca que compreende cerca de 5-8% de todas as células 3. Após um insulto desmielinizante, OPCs migram para o local da lesão, proliferar, diferenciar e para substituir as bainhas de mielina perdidas ou danificadas em axónios expostas. No entanto, em algumas configurações de doença / lesão, este processo é encontrado para ser ineficiente ou pode falhar completamente 4. Enquantodesmielinização crónica é pensado para aumentar a carga de doença, oligodendrogenesis eficiente e remielinização pode aliviar os sintomas 5. Tem sido, portanto, de interesse para o estudo OPCs in vitro para determinar o efeito dos factores experimentais sobre oligodendrogenesis.
Visão sobre as diferentes fases de diferenciação de oligodendrócitos tem sido possível pela identificação de marcadores de células específicas do estágio. A auto-renovação de células progenitoras iniciais são definidas pela sua expressão de plaquetas derivadas de receptores de factor de crescimento alfa (PDGFRα), antigénio neuronal / glia 2 (NG2) e A2B5 6-8. Como OPCs iniciar o seu programa de diferenciação e retirar-se do ciclo celular, eles regular negativamente a expressão destes marcadores e começam a expressar proteínas indicativas de premyelinating incluindo oligodendrócitos cíclica-fosfodiesterase de nucleótidos 3'-(CNPase) e O4. Finalmente, a sua diferenciação em oligodendroc mais maduroytes é caracterizada pela expressão de proteínas associadas à mielina, incluindo a glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína proteolipidica (PLP), e proteína básica de mielina (MBP). MBP é uma proteína de membrana periférica intracelular e um grande componente da bainha de mielina. Camundongos sem MBP desenvolver um fenótipo grave em que a mielinização do SNC é significativamente diminuir, levando a tremores, convulsões e morte precoce 9,10. Este papel importante de MBP na mielinização tem levado ao seu uso como um marcador de diferenciação de oligodendrócitos de vitro e in vivo 11.
Quantificação da MBP pode ser conseguido usando várias metodologias diferentes. A análise de Western blot e RT-PCR para permitir que a quantificação dos níveis de MBP sob diferentes regimes de tratamento. Imunocitoquímica é uma abordagem qualitativa comum que também pode ser quantitativa, quando são usados métodos de microscopia baseado em câmera. Embora estes sistemas sejam fiáveis e fundamentalo estudo da diferenciação de oligodendrócitos, cada um tem as suas próprias desvantagens que limitam a sua utilização na triagem de drogas. Em primeiro lugar, a quantidade de OPCs primárias que são necessários para RT-PCR e análise por Western blot reduz o número de variáveis que podem ser examinados simultaneamente. Embora a exigência celular para imunocitoquímica é muito menor, um tempo considerável deve ser dedicado a cada experiência, se a quantificação é o objetivo. Numerosos imagens devem ser capturados e, em seguida quantificado para facilitar a análise experimental. Estas advertências tornam-se obstáculos importantes a considerar para estudos que requerem avaliação de alto rendimento. Descrevemos aqui um método que utiliza os aspectos fundamentais de tanto a imunocitoquímica e metodologias de Western blot para quantificação de mielina, enquanto reduz significativamente tanto o número de células necessário para completar o tempo e a análise quantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve um método rápido e fiável para o isolamento e quantificação de rato OPCs no oligodendrogenesis vitro em resposta a factores experimentais. Usando selecção positiva, altos rendimentos de OPCs viáveis e puros são usados diretamente para fins experimentais. Este método simplifica o isolamento, cultivo, e passos de diferenciação em um quadro de tempo de 1 semana, e as células fixas pode ser convenientemente armazenada a 4 ° C, durante várias …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant patrocinador: Institutos Nacionais de Saúde; número de concessão: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
Referências
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