쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
포유 동물의 중추 신경계 (CNS)의 효율적인 신경 전도는 희소 돌기 아교 세포에 의한 축삭의 수초가 필요합니다. 개발하는 동안, 희소 돌기 아교 세포는 개발 전뇌 신경 관 (1)의 심실 영역에서 마이그레이션 생각되는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 (개 OPC)의 풀에서 발생한다. 마이그레이션 개 OPC는 성숙 myelinating 희소 돌기 아교 세포로 분화 한 후 효율적인 임펄스 전파를 용이하게 할뿐만 아니라 영양 지원 2 축삭을 제공 할뿐만 아니라. 성인 CNS는 모든 셀 3의 약 5-8%를 포함하는 회색과 흰색 물질 전반에 걸쳐 분산 개 OPC의 풍부한 인구를 유지한다. 탈수 초성 모욕에 따라, 개 OPC는 부상의 사이트로 마이그레이션 증식, 노출 축삭에 분실 또는 손상된 미엘린 수초를 대체하는 차별화. 그러나, 일부 질병 / 부상 설정에서,이 공정은 비효율적 인 것으로 판명되거나 완전히 4 실패 할 수있다. 동안만성 탈수 초화는 증상 (5)을 완화 할 수있다 질환, 효율적인 oligodendrogenesis 및 재유 수화의 부담에 추가 할 생각된다. 따라서 oligodendrogenesis에 실험 인자의 효과를 결정하기 위해 시험 관내 연구 OPC에 관심있다.
희소 돌기 아교 세포 분화의 상이한 단계로 통찰 단계 특정 세포 마커의 식별에 의해 가능하게되었다. 자기 갱신 초기 전구 세포, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (α)의 발현 (PDGFRα)에 의해 정의되는, 신경 / 신경교 항원이 (NG2)과 A2B5 6-8. OPC를 자신의 분화 과정을 개시하고, 세포주기로부터 탈퇴, 그들은 이러한 마커의 발현을 하향 조절 및 고리 뉴클레오티드 3'- 포스 (CNPase) 및 희소 돌기 아교 세포를 포함 O4 premyelinating 나타내는 단백질을 발현하기 시작한다. 마지막으로, 더 성숙한 oligodendroc으로 분화, 킬로바이트는 미엘린 관련 당 단백질 (MAG), 테오 단백질 (PLP), 및 미엘린 염기성 단백질 (MBP)을 포함하여 수초 관련 단백질의 발현을 특징으로한다. MBP는 세포 내 주변 막 단백질과 수초의 주요 구성 요소입니다. MBP 결핍 마우스는 CNS의 수초 크게 떨림, 경련 및 조기 사망 9,10 선도 저하되는 심각한 표현형을 개발한다. 수초에서 MBP의 중요한 역할은 생체 외 및 생체 (11) 모두 희소 돌기 아교 세포 분화 마커로서의 사용하게되었다.
MBP 정량은 몇 가지 다른 방법을 사용하여 달성 될 수있다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 다른 치료 요법에서 MBP 수준의 정량화를 허용합니다. 면역 세포는 현미경 카메라 기반 방식이 사용되는 경우도있을 수있는 양적 질적 일반적인 접근법이다. 이 시스템은 안정적이고 근본적인 있지만희소 돌기 아교 세포 분화 연구는 이들이 각각의 약물 선별에서 이들의 사용을 제한하는 고유 단점을 갖는다. 우선, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 필요한 기본 OPC에 량이 동시에 검사 할 수있는 변수의 수를 감소시킨다. 면역 세포에 대한 세포의 요구 사항이 훨씬 낮은 반면 정량화가 목표 인 경우, 상당한 시간이 각 실험에 전념해야합니다. 다수의 이미지를 캡쳐 한 후 실험적 분석을 용이하게 정량한다. 이러한주의 사항은 높은 처리량 평가를 필요로 연구에 고려해야 할 중요한 장애물이된다. 크게 필요한 세포의 수 및 정량 분석을 완료하는 데 시간을 모두 줄이면서 여기에서 우리는, 면역 세포 및 수초의 정량 웨스턴 블롯 방법론 모두에서 근본적인 측면을 활용하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 쥐 개 OPC를 분리하고 실험적인 요인에 반응하여 체외 oligodendrogenesis의 정량화를위한 빠르고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 긍정적 인 선택을 사용 가능한 순수 개 OPC의 높은 수율은 실험 목적에 직접 사용됩니다. 이 방법은 1 주일 기간에 분리 배양, 분화 단계를 간소화하고, 고정 된 세포는 편리하게 분석 감도의 손실없이 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
; 건강의 국립 연구소 : 스폰서 부여 허가 번호 : R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
Referências
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