Myelogen Cell Isolasjon fra Mouse Hud og Drenering Lymph Node Etter Intradermal Immunisering med levende svekket<em> Plasmodium</em> Sporozoitter
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malaria infeksjon begynner når sporozoitten stadium av Plasmodium inokuleres inn i huden til en pattedyrvert gjennom et myggstikk. Den svært bevegelige parasitten ikke bare når leveren å invadere hepatocytter og forvandle seg til erytrocytt-infeksiøs form. Det vandrer også inn i huden og til den proksimale lymfeknute drenering injeksjonsstedet, der det kan bli anerkjent og degradert av fastboende og / eller rekruttert myeloide celler. Intra bildebehandling rapporterte tidlig rekruttering av sterkt fluorescerende Lys-GFP positive leukocytter i huden og samspillet mellom sporozoites og CD11c + celler i drenering lymfeknuter. Vi presenterer her en effektiv prosedyre for å komme seg, identifisere og spesifisere de myeloide celle undergrupper som er rekruttert til musen huden og drenering lymfeknute etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av sporozoites i en musemodell. Fenotypisk karakterisering ved hjelp av multi-parametrisk flyt gir cytometrien pålitelig analyse for å vurdere tidlige dynamiske celleforandringer i løpet av inflammatoriske respons på Plasmodium infeksjon.
Introduction
Malaria er en av de dødeligste smittsomme sykdommer i verden, drepte mer enn en halv million mennesker i året. Infeksjon av Plasmodium, den kausale midlet av sykdommen begynner ved en pre-erythrocytisk (PE) fase. I løpet av denne fasen, sporozoitter injiseres i vertens hud ved en kvinnelig Anopheline mygg når leveren via blodet og differensiere inne hepatocytter til parasitten former som infiserer røde blodceller og forårsaker symptomene på sykdommen.
PE stadier av Plasmodium representerer en privilegert mål for anti-malaria vaksinasjon. Faktisk, svekkede levende vaksiner mot disse fasene, som for eksempel stråling dempes sporozoites (RAS), har genetisk arrestert parasitter (GAP) eller kjemoprofylakse og sporozoites (CPS) vist sin evne til å beskytte både gnager og menneskelige verter 1-9. I gnager modellen, er de fleste vaksinasjonsstudier utført utnytte intravenøs immunisering, Som er gullstandarden i form av beskyttende effekt. Imidlertid har beskrivelse av en hud scenen og viktigheten av huden assosierte drenering lymfeknute (DLN) i fremlokkende beskyttelse endret vår oppfatning av PE fase og understreket viktigheten av intradermal ruten for injeksjon. Intra avbildning av P. berghei sporozoitter injisert inn i huden av gnagere har vist at bare ~ 25% av inokulumet når leveren via blodet. De resterende ~ 75% fordeles mellom den proksimale DLN (~ 15%) og huden (~ 50%) 10,11, hvor en liten andel kan transformere og forblir i live i flere uker inne hudceller 12,13. Videre påfølgende studier beskrevet at etablering av effektive beskyttende immunitet etter intradermal immunisering skjer hovedsakelig i den hud-DLN, hvor parasitten spesifikke CD8 + T-celler blir aktivert, og bare marginalt i milt eller lever-dLNs 14,15.
Mensde fleste studier har konsentrert seg om karakterisering av effektorceller innblandet i etableringen av beskyttende immunrespons, er mye mindre kjent om skjebnen til levende svekkede parasitter injiseres i huden, spesielt deres interaksjon med det medfødte immunsystemet. Spesielt karakterisering av antigen-presenterende celler som er involvert i parasitt-antigen opptak, prosessering og presentasjon til CD8 + T-celler er av avgjørende betydning, og vite at PE-antigen anskaffelse kan skje både i huden og DLN kamrene. Tidligere intra imaging studier beskrevet en tidlig tilstrømning av sterkt fluorescerende Lys-GFP positive celler i huden etter en smittsom myggstikk 16 mens ble observert tidlig interaksjoner mellom sporozoites og dendrittiske celler i DLN 10,17. Mer nylig er det blitt rapportert at sporozoitter inokulert i huden av mygg øker motiliteten av både dendrittiske og regulatoriske T-celler i hudenmus, mens en reduksjon av antall antigen-presenterende celler ble observert i den DLN 18.
Vi forsøkte å identifisere og kvantifisere mer presist de leukocytt undergrupper rekruttert i huden og tilsvarende DLN så vel som de i samspill med parasitten etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av RAS 19. I denne sammenheng, isolerte vi myeloide celler (CD45 + CD11b +) fra både vevet og karakterisert subpopulasjoner av interesse ved fler = parametre strømningscytometri. I samsvar med den immunrespons som beskrives i den tidlige fasen av Leishmania større hudinfeksjon 20, den primære vertsrespons til sporozoitten injeksjon består av en suksessiv rekrutteringen av polymorfonukleære neutrofiler (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) etterfulgt av inflammatoriske monocytter (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) som er identifisert på grunnlag av differensiertal uttrykk for Ly6G og Ly6C overflatemarkører.
Vi beskriver her en protokoll for å isolere myeloide celler fra mus hud og DLN etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av RAS hentet fra infiserte mygg spyttkjertlene. Reproduserbare intradermale injeksjoner og behandling vev er viktige skritt for å kvantifisere fenotypiske endringer av infiltrerende cellepopulasjon innenfor infisert vev. Tilnærmingen beskrevet nedenfor gir en pålitelig analyse for å vurdere huden og DLN inflammatoriske respons på Plasmodium parasitten og kan utvides til ulike eksperimentelle systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det perspektivet i stor skala vaksinasjon av mennesker som bruker en hel sporozoitt malaria vaksine, er en av hovedutfordringene for å overvinne for å utvikle optimaliserte ruter og metoder for parasitten administrasjon for å sikre vellykket immunisering og beskyttelse 24,25. Hos mennesker har evalueringen av beskyttende effekt mediert av levende svekkede parasitter (LAP) utført følgende naturlig myggstikk 2, samt intradermal, subkutan 25,26 og IV vaksinasjoner 27. Som …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Patricia Baldacci, Vanessa Lagal og Sabine Thiberge for kritisk lesing, Irina Dobrescu og Sabine Thiberge om hjelp i å ta bilder og Pauline Formaglio for undervisning in vivo avbildning av sporozoitt motilitet i musen huden. Vi vil også gjerne takke Marek Szatanik og Senter for Produksjon og infeksjon av Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) for mygg oppdrett. Denne studien ble støttet av AXA forskningsfond og midler fra Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases" (gi no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Referências
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
