Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
Con l'avvento dei -omica si avvicina la nostra comprensione delle malattie croniche come il cancro e la sindrome metabolica è migliorata. Tuttavia, efficace estrazione di informazioni contenute nei set di dati di grandi dimensioni che si ottengono da microarray di espressione genica, esperimenti di sequenziamento profonde o profili metabolici è essenziale per scoprire e quindi efficacemente indirizzare i regolatori critici del fenotipo delle cellule malate. Estrogen Receptor α (ERα) è uno dei fattori di trascrizione maestro che regolano i programmi genetici che sono importanti per i tumori al seno estrogeno sensibili. Al fine di comprendere il ruolo di ERα segnalazione in seno metabolismo del cancro abbiamo utilizzato i dati trascrittomica, cistromic e metabolomica da MCF-7 cellule trattate con estradiolo. In questa relazione abbiamo descritto la generazione di campioni per l'RNA-Seq, Chip-Seq e gli esperimenti di metabolomica e l'analisi computazionale integrativa dei dati ottenuti. Questo approccio è utile nel delineare romanzo talpameccanismi colari e circuiti gene regolatore che sono regolati da un particolare fattore di trascrizione che impatti il metabolismo delle cellule normali o malati.
Introduction
Gli estrogeni sono importanti regolatori di molti processi fisiologici in entrambi i maschi e femmine, tra cui tessuti riproduttivi, tessuti metabolici, cervello e ossa 1. Oltre ai benefici effetti in questi tessuti, estrogeni guidare anche i tumori che derivano da mammaria e tessuti riproduttivi. Estrogeni lavorano principalmente attraverso ER per indurre effetti specifici tipo di cellula. sequenziamento profondo delle trascrizioni regolate da ERα utilizzando RNA-Seq e genome-wide ERα DNA analisi siti di legame con ChIP-Seq ha dimostrato di essere utile per capire come funziona ERα in diversi tessuti e tumori che ne derivano. Noi e altri abbiamo pubblicato profili di espressione genica associati a recettori diversi (ERα vs ERβ) 2,3, differenti ligandi 3-5 e diverse coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq è il metodo principale per esaminare il trascrittoma, offrendo una maggiore precisione ed efficienza rispetto a ba microarraygene sed analisi di espressione 8. RNA ottenuto da linee cellulari 2-4,7, tessuti o campioni di tumore sono in sequenza, mappato alle assemblee genomiche disponibili e geni differenzialmente regolati sono identificati. Immunoprecipitazione della cromatina (chip) è impiegato per sezionare il fattore di trascrizione e coregulator legame con noti siti di normative vincolanti cromatina. ChIP-Seq (ChIP seguita da alta sequenziamento rendimento) fornisce il rilevamento imparziale dei siti di legame a livello mondiale. Metabolomica è un altro approccio di sistema biologico sempre più utilizzato, che quantitativamente misure, risposta multiparametrica dinamica dei sistemi viventi a vari stimoli, tra cui i prodotti chimici e le perturbazioni genetiche.
Eseguendo profilo metabolico globale, una lettura funzionale può essere ottenuta da cellule, tessuti, e sangue. Inoltre, le informazioni da esperimenti trascrittoma non riflettono sempre i cambiamenti reali nel livello di enzimi che contribuiscono alla vie biochimiche. Combinatoanalisi dei dati trascrittoma e metaboloma ci permette di identificare e correlare i cambiamenti nell'espressione genica con i cambiamenti dei metaboliti attuali. Sfruttando le informazioni provenienti da tutti questi gruppi di dati su larga scala forniscono i dettagli meccanicistici per comprendere il ruolo dei fattori di trascrizione che regolano i sistemi biologici complessi, in particolare quelli che riguardano lo sviluppo e malattie come il cancro e il diabete umano.
La natura complessa del genoma dei mammiferi rende difficile integrare e interpretare i dati ottenuti dagli esperimenti trascrittoma, cistrome e metaboloma completamente. Identificare gli eventi di legame funzionali che avrebbe portato a cambiamenti nell'espressione dei geni bersaglio è importante perché una volta che i siti di legame funzionali sono identificati; conseguente analisi, tra cui vincolante di trascrizione (TF) analisi motivo, potrebbero essere eseguite con maggiore accuratezza. Questo porta alla identificazione di cascate TF biologicamente significativi e meccanismi. Comparis anche direttisu esperimenti RNA-Seq e Chip-Seq non sempre possibile in quanto i dati di ciascun esperimento sono diverse scale e rumori e in alcuni casi segnali significativi vengono oscurati dal rumore popolazione. Non siamo a conoscenza di alcun studio che integra le informazioni da questi tre approcci indipendenti ma collegati per capire la regolazione metabolica diretta da ERα nel cancro al seno. Pertanto, il nostro obiettivo generale di questo lavoro è di mettere in relazione gli eventi produttivi vincolanti alle espressione genica e le modifiche dei metaboliti. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo integrato i dati da RNA-Seq, Chip-Seq esperimenti e metabolomica e individuato i estrogeni indotti ERα eventi che avrebbero portato a cambiamenti di espressione genica in vie metaboliche vincolante. Per la prima volta, mettiamo a disposizione un set completo di protocolli (Figura 1) per la generazione di ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolomica profiling e l'esecuzione di analisi integrativa dei dati per scoprire circuiti genici romanzo che regolano il metabolismo del senolinee cellulari di cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, abbiamo descritto la generazione e l'analisi integrativo di RNA-Seq, Chip-Seq dati e metabolomica da cellule MCF-7 che sono trattati con E2. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli strategizing di utilizzare i metodi più efficienti e user-friendly articoli molli che producono scoperta biologicamente rilevanti. A nostra conoscenza, il nostro è il primo studio a integrare omiche dati provenienti da tre diverse analisi e nuove vie metaboliche identificate che ERα regolato direttamente nelle ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, premio ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
Referências
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