An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Alle next-generation sequencing (NGS) procedures omvatten testen uitgevoerd in het laboratorium bench ( "wet bench") en data-analyses met behulp van bioinformatica pijpleidingen ( "dry bench"). Beide elementen essentieel om nauwkeurige en betrouwbare resultaten, die van essentieel belang voor klinische laboratoria produceren. Gerichte NGS technologieën hebben in toenemende mate genade gevonden in de oncologie-toepassingen vooraf precisie geneeskunde doelstellingen te helpen, maar de werkwijzen omvatten vaak losgekoppeld en variabele natte en droge bank workflows en ongecoördineerde reagens sets. In dit rapport beschrijven we een werkwijze voor sequentiebepaling tegen kanker monsters met een 21-gen paneel als voorbeeld van een algehele gerichte NGS systeem. Het systeem integreert functionele DNA kwantificatie en kwalificatie, single-tube multiplex PCR verrijking, en de bibliotheek zuivering en normalisatie met behulp van analytisch-geverifieerd, single-source reagentia met een standalone bioinformatica suite.Daardoor nauwkeurige variant oproepen van lage kwaliteit en lage hoeveelheid formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) tumor biopsieën worden bereikt. De methode kan routinematig beoordelen kanker-geassocieerde varianten van een invoer van 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, en is modulair opgebouwd om nieuwe gen inhoud tegemoet te komen. Twee verschillende types van analytisch ingestelde controles zorgt voor kwaliteitsborging en hulp bescherming call nauwkeurigheid klinisch relevante monsters. Een flexibele "tag" PCR stap bedt platform-specifieke adapters en index-codes om te proeven barcoding en verenigbaarheid met gemeenschappelijke benchtop NGS instrumenten mogelijk te maken. Belangrijk is dat het protocol is gestroomlijnd en kan 24 sequentie-ready bibliotheken te produceren in een enkele dag. Ten slotte is de aanpak koppelt natte en droge bank processen door de integratie van pre-analytisch monster kwaliteitscontrole resultaten direct in de variant bellen algoritmen om mutatie detectie nauwkeurigheid te verbeteren en te differentiëren vals-negatieve en indeterminate gesprekken. Deze doelgerichte NGS methode maakt gebruik van de vooruitgang in zowel wetware en software om high-diepte, multiplex sequencing en gevoelige analyse van heterogene kanker monsters voor diagnostische toepassingen te realiseren.
Precisie medicijnen gebaseerd op de individualisering van diagnostische en therapeutische opties voor patiënten. De belofte van behandelingen op maat is een direct gevolg van een beter begrip van de ziekte trajecten die de koppeling van moleculaire diagnostiek en gerichte therapieën kunnen informeren. Bijvoorbeeld, het gebruik van moleculair-gerichte therapieën gestegen van 11% tot 46% 2003-2013 1, en anti-kanker geneesmiddelen zoals vemurafenib en crizotinib zijn FDA goedgekeurde met automatisch diagnostische tests. Met de mogelijkheid om nauwkeurig terug lage abundantie sequentie doelen uit sterk gemultiplexeerde sample sets, is de volgende generatie sequencing (NGS) naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het evalueren van genetische afwijkingen geassocieerd met kanker en het identificeren van moleculaire doelwitten voor precisie geneeskunde.
De meest voorkomende solide tumor biopten voor moleculaire testen omvatten in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) specimensens. Deze monsters zijn beladen met een lage hoeveelheid en / of lage kwaliteit nucleïnezuren die uitdagen accurate NGS assessments 2-5. De huidige commerciële NGS methoden voor de analyse van deze monsters zijn gebaseerd op een lappendeken van verschillende reagentia, protocollen en informatica tools die bewegende doelen van voortdurende verbeteringen te vertegenwoordigen. Bijvoorbeeld veranderingen in bepalingsbuffer chemie en / of software gebeurde elke 1-2 maanden voor de meest gebruikte gerichte NGS kits 6. Deze instabiliteit weerspiegelt een gebrek aan samenhang in de bouw en het verifiëren van een uniform systeem voor het NGS uitdagende types monster, in het bijzonder voor het testen van kanker, en legt een te grote last op laboratoria om samenhangende protocollen die zijn geoptimaliseerd van sample-to-resultaten te ontwikkelen. Inderdaad, een recent onderzoek van NGS gebruikers gewezen op de problemen van deze "snel veranderende" technologieën, samen met de eisen voor gevestigde, medisch-bruikbare inhoud, verschanst bioinformatica deskundigheid, een solidified en geïntegreerde procedure die snel kan worden uitgevoerd, en gestroomlijnde workflows en vereenvoudigde protocollen die te vergemakkelijken on-the-job training 7. In dit artikel wordt een uitgebreid systeem voor gerichte NGS beschreven dat deze lacunes adressen.
De gepresenteerde methodiek integreert alle stappen in de procedure van pre-analytische post-analytische bij zowel natte als droge banken om de nauwkeurigheid, gevoeligheid en betrouwbaarheid van de doelgroep kwantificering en opsporing verbeteren NGS van klinisch relevante kankergen loci. Deze aanpak begint met de kwantificering van de 'functionele' DNA 4 tot DNA-kwaliteit te beoordelen, begeleiden inbreng in het PCR verrijking stap, en bescherming tegen vals-positieve gesprekken die kunnen voortvloeien uit het verhoor van de zeer lage template exemplaren. Een single-tube multiplex PCR verrijkt vervolgens voor 46 loci in 21 kankergenen met behulp van slechts 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, gevolgd door incorporatie van platform-specifieke sequenties voor NGS using gewone desktop sequencing instrumenten. Bibliotheken worden gezuiverd met behulp van een eenvoudige magnetisch bolletje procedure en gekwantificeerd met een roman, kalibratie-vrij qPCR assay. Een standalone bioinformatica suite, op basis van DNA-monster QC resultaten aan de oproep van de prestaties te verbeteren, biedt sequentieanalyse volgende NGS. We presenteren gegevens met behulp van deze systemen aanpak voor gerichte NGS naar base-substitutie mutaties, insertie / deleties (indels) te onthullen, en kopieer het aantal varianten (CNV) en lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumor biopten zoals FFPE en FNA samples, en run controles.
NGS technologieën zijn verwachtingen voor het ondervragen van de moleculaire profielen van de tumor biopten in klinische settings 9 geherdefinieerd. Een aantal gerichte NGS panelen zijn ontwikkeld als onderzoekstechnologieën, laboratorium ontwikkelde testen, en in de handel verkrijgbare producten en aangepaste panelen voor het beoordelen van meerdere typen klinische monsters 3,5,10-15. Verslagen van meerdere onderzoeken is de waarde van NGS aangetoond dat een gevoelige en specifieke klinische instrument voor de detectie van genomische veranderingen 3,10-12,14. Toch blijkt overigens het risico van artefacten die vals positieve resultaten uit uitdagende kanker biopsies zoals FFPE specimens 2-5,12,14 kunnen veroorzaken. Daarnaast hebben recente publicaties hoge uitvalpercentages gemarkeerd voor NGS gebruik oncologie exemplaren 16 en vals-positieve gesprekken met commercieel gerichte NGS panelen die worden verergerd door het gebruik van low-input DNA-12. Daardoor sommige LaboraTories zijn ofwel aangepast of extra checks and balances toegevoegd aan in de handel verkrijgbare gerichte NGS technologieën om de prestaties te verbeteren, vaak om de nauwkeurigheid te waarborgen of te bevestigen de bevindingen uit de bioinformatica analyses 5,10,11.
De 21-gen (zie figuur 2) werd ontwikkeld als gerichte content voor een uitgebreid NGS systeem om evidence-based, bruikbare mutaties ondervragen in moeilijke types monster zoals FFPE en FNA tumor biopten. De workflow heeft een aantal voordelen: 1) de samenhang door het verstrekken van een uniforme amplicon dekking (figuren 3 pt 4, tabel 3); 2) het gemak van het gebruik door het verstrekken van pre-geformuleerde, geoptimaliseerde reagens sets, en vereenvoudiging van de bioinformatica eisen; 3) de efficiency door het stroomlijnen van de workflow en het verminderen van het aantal pipetteren stappen in vergelijking met andere commerciële NGS methoden; en 4) de nauwkeurigheid door het opnemen van een DNA-QC-test voor het beoordelen van de versterkerkunnen DNA copy number om ervoor te zorgen aanvaardbare template diversiteit en vermijd stochastische fluctuaties in variant detectie 4. De integratie van de pre-analytische QC data met de bioinformatica analyse maakt lage ingangen van FFPE DNA. Dit werd bereikt door het trainen van een beslissing-tree algoritme met behulp van verschillende functionele kopieën van DNA-ingang over 400 FFPE monsters met onafhankelijke maatregelen van de waarheid, en de integratie van dit algoritme in de bio-informatica-software. Daardoor is de aanbevolen inbreng van 400 amplificeerbare exemplaren, meestal gelijk aan ~ 5-20 ng FFPE DNA, steekt gunstig af bij andere methoden 10-12, waaronder hybridisatie gebaseerde Verrijking ~ 250 ng DNA aanbevolen FFPE 17,18 . Hoewel de techniek is beschreven voor gebruik op een MiSeq platform kan worden gemodificeerd door Tag PCR primers met instrument-specifieke adapters sequentieanalyse andere NGS platforms mogelijk.
Verschillende stappen zijn van cruciaal belang om succes te garanderenvan de procedure. De pre-analytische QC assay bepaalt het amplificeerbare aantal kopieën van DNA en rapporten functionele remming. Indien echter minder dan 400 amplificeerbaar DNA kopieën worden in de PCR verrijkingsstap, er een verhoogd risico op vals-negatieve telefoontje van monsters met een lage abundantie mutaties (figuur 6). Bovendien moet zorg gedurende bibliotheek zuivering worden genomen lang drogen van de magnetische korrels tijdens de was- of elutiestappen voorkomen. Bovendien succesvol bibliotheek kwantificering is sterk afhankelijk van de juiste verdunning van DNA bibliotheek. Voor het beste resultaat, het verschil van de qPCR resultaten voor samplebibliotheek (Cq FAM) vergeleken met de standaard LQ (Cq VIC) moet ≤3.3 Cq. Indien het verschil groter is dan 3,3 Cq, re-verdunning en testen van het monster wordt aanbevolen. Hoewel een uitstekende correlatie waargenomen tussen deze competitieve qPCR methode en commerciële kits die absolute kwantificatie met behulp van een standaardcurve biedenEen offset van de bibliotheekinvoer in de klonale amplificatie stap ten opzichte van andere werkwijzen noodzakelijk zijn om optimale zaaidichtheid bereiken.
Sommige kanker exemplaren zijn bijzonder uitdagend om te sequencen omdat remmers die blijven bestaan na DNA-isolatie. Om deze monsters voorafgaand aan de bibliotheek preparaat kunnen identificeren, de qPCR QC test detecteert ook versterking remming door het opnemen van een exogene template dat dient als zowel een interne controle en een schildwacht voor functionele remming. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 3 waarin een melanoom DNA monster niet de QC remming gegeven voorafgaand aan sequencing passen en niet een library die kan worden gesequenced genereren. Het falen zou waarschijnlijk een gevolg van melanine vervuiling, een bekende remmer PCR, uit het FFPE DNA isolatiestap uitgevoerd. Monsters die worden geïdentificeerd door de QC-test te worden met het risico voor de amplificatie falen kan worden gered door middel van een extra clean-up stap to verwijderen potentiële remmers.
De beoogde 21-gen panel richt zich op evidence-based-gen hotspots en biedt een compleet systeem met geoptimaliseerde reagentia en controles voor DNA QC, NGS en bioinformatica software die wordt geïnformeerd door pre-analytische "functioneel" DNA kwantificering resultaten. De werkwijze detecteert nauwkeurig base-substitutie mutaties en indels van extensieve DNA, en een voorbeeld van een NGS systeem de mogelijkheid inhoudskader breiden, om extra varianten zoals CNVs detecteren en aangepast voor gerichte RNA sequentie.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr. Annette Schlageter voor de herziening van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie CP120017 van de Cancer Prevention and Research Institute of Texas (PI: GJL).
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |