Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
Иммуногистохимия (IHC) является стандартным методом лаборатории для обнаружения белка в ткани, и IHC до сих пор широко используется в обоих исследованиях и диагностике патологий. Оценка IHC окрашивания часто полуколичественный, представляя потенциальную систематическую ошибку в интерпретации результатов. Многие Полуколичественные подходы были разработаны , которые включают как интенсивность окрашивания и окрашивания степени в окончательный диагноз 1-4. Другие системы включают балльной интенсивности и субклеточном положение для того , чтобы лучше локализовать выражение 5. Включение средних баллов из нескольких зрителей часто используется для того , чтобы свести к минимуму влияние единого зрителя смещения 6. Несмотря на эти усилия, субъективность в анализе до сих пор остается, в частности , при оценке степени окрашивания 7. стандартизации протокола и сведение к минимуму субъективность от человеческого фактора имеет первостепенное значение для создания точных и воспроизводимых результатов IHC.
Содержание "> Есть и другие варианты , кроме IHC для определения экспрессии белка в тканях. В условиях исследования, иммуногистохимии традиционно рассматривается как средство для изучения локализации белка 8, в то время как другие методы , такие как иммуноблоттинга рассматриваются как золотой стандарт для исследования экспрессии белка . Определение ткани или экспрессии компартмент клетки конкретных трудно без включающее в себя передовые методы , такие как фракционирования клеток или лазерной захвата микродиссекции 9,10. использование флуоресцентных антител на слайдах ткани предлагает разумный компромисс, но фон аутофлуоресценция из – за NADPH, lipofuscins, ретикулярная волокна, коллаген, эластин и может сделать точные количественное трудно 11.Автоматизированная вычислительная патология платформы являются перспективным направлением для более объективной количественной оценки патологии окрашивания 12-15. Сочетание мультиспектральных изображений с микрочипов тканиспособствует высокой пропускной анализ экспрессии белка в больших размерах выборки. С помощью этих методов, анализ белка совместной локализации, окрашивая гетерогенности и ткани и внутриклеточной локализации возможно при существенном снижении как неотъемлемые уклоны и время , необходимое для анализа, при возвращении данных в непрерывном , а не категорическим формате 16. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать полезность и методологии для выполнения мультиплексированный иммуногистохимии с анализом, с использованием мультиспектральных изображений программного обеспечения.
Этот протокол написан для ручного, мультиплекс иммуногистохимического окрашивания одной секции ткани слайде с четырьмя оптимизированными моноклональных антител. В качестве показательного эксперимента, ядерный анти-кроличий альфа-рецептора эстрогена (ERα) и рецептор андрогена (AR) мультиплексируются с мембраной анти-мышиного CD147 и мембраносвязанного анти-мышиного Е-кадгерина. Любое антитело выбора может быть substitutе изд антител, перечисленных в данном описании, но каждая комбинация антител требует отдельной оптимизации. Предварительная обработка для всех антител, должны быть идентичными. АР и CD147 антитела должны быть оптимизированы индивидуально, а затем в виде коктейля. Каждое антитело обнаруживают с использованием биотин-свободной полимерной системы, и один из 4-х уникальных хромогенами.
Использование традиционных иммуногистохимии для оценки экспрессии белка ограничивается субъективными, полуколичественного методов анализа 22,23. Advance платформы были созданы для высокой пропускной способности анализа экспрессии биомаркеров и локализации. Подробный сегментация…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Университета штата Висконсин трансляционных исследований инициатив в лаборатории патологии, в частности при поддержке UW кафедры патологии и лабораторной медицины и грант UWCCC P30 CA014520, для использования его объектов и услуг.
Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |