기능 보완 분석 (FCA) : 설계 및 생화학 적 경로의 교육을 보완하기 위해 구현 된 실험실 운동
Summary
생화학 적 경로에 관여하는 효소 활성의 유효성 기능성 상보성 분석 (FCA)를 사용하여 설명 될 수있다. 아미노산, 세균 엄격한 반응 세균 펩티도 글리 칸의 생합성의 대사에 관여하는 효소의 효소 활성을 보여주는 FCA 분석이 논문에 설명한다.
Abstract
기능성 상보성 분석 (FCA)는 널리 유전자 / 효소의 기능 / 역할을 규명하기 위해 사용되는 생체 내 분석이다. 이 기술은 생화학, 유전학 및 기타 여러 분야에서 매우 일반적입니다. 기술의 포괄적 인 개요 펩티도 글리와 세균 엄격한 응답이 원고에보고 산, 아미노에 관련된 생화학 적 경로의 가르침을 보완합니다. 라이신 (L, L-디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)과 티로신 및 페닐알라닌의 대사에 관여하는 티로신 아미노 전이 효소 (tyrB)의 대사에 관여하는 모델 식물 생물 애기 장대에서 두 cDNA를가 강조 표시됩니다. 또한, 세균 펩티도 글리 신진 대사 경로는 십자가에 포함 된 세균 Verrucomicrobium spinosum 등의은 UDP N -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 아제 (무레) 유전자의 분석을 통해 강조펩티도 글리의 -linking. 세균 엄격한 응답도. RSH (R 영어 / s의 냄비 시간 omolog) 박테리아 Novosphingobium 특검팀의 하이퍼 점액 표현형에 대한 책임 관능 성 유전자의 분석을 통해보고 FCA의 네 가지 예를 제시한다. 동영상 즉 리신, 펩티도 글리 칸과 반응 엄격한 이들 세에 초점을 맞출 것이다.
Introduction
유전자의 기능 (들)을 해명 / 역할 (들)의 맥락에서 기능적 상보성은 상동 야생형 상태로 관찰 표현형으로 특정 돌연변이를 복원하는 특정 동종 또는 orthologous 유전자의 능력으로 정의된다 또는 orthologous 유전자 돌연변이 배경으로 시스 또는 트랜스에 도입된다. 이 기술은 넓게 분리 및 기능 (들)는 많은 유전자 / 역할 (들)을 식별하는 데 사용되어왔다. 하나의 특정 예는 S. URA3의 돌연변이를 사용하여 칸디다 알비에서 orotidine -5- 인산 라제의 분리 및 식별이며 cerevisiae의와 E.의 pyrF 돌연변이 대장균. 한 저자는 아미노산, 펩티도 글리 칸과 그 연구 프로그램에서 엄격한 반응의 대사에 관여하고 B에서의 교시 프로그램에이 기술을 도입 한 유전자의 기능을 규명하기 위해이 기술을 사용한iotechnology 및 분자 생명 과학 (BMB) 기술의 로체스터 대학 (RIT)에서 프로그램.
원칙과 사례 (BPP) (허드슨 / Savka)는 RIT에서 BMB 프로그램에서 두 개의 상 부문 과목 실험실 기초 과정 : 저자는 식물 생화학 / 병리학 (FPBP) (허드슨)와 Bioseparations의 기본을 가르친다. 과정에서 설명하는 주제 중 일부는 자신의 연구 분야에 소속되어 있기 때문에, 저자는이 두 실험실 기반의 과정으로 각각의 연구 프로그램에 사용되는 기술과 실험 도구의 대부분을 포함하고있다. 이러한 하나의 예는 식물, 펩티도 글리 칸과 세균에서 엄격한 반응 대사로부터 대사 산 아미노기에 관한 강의 자료를 강화 실험실 운동 기능성 보완한다.
FPBB 과정에서 논의 식물에서 아미노산 경로의 세 가지가 있습니다 그 라이신 (리스)의 티로신(티르) 및 페닐알라닌 (프). 동물리스 드 노보 합성에 유전 장치가 부족하기 때문에리스 통로 때문에 모든 동물, 특히 인간을위한 필수 아미노산과 같은 아미노산의 중요성 과정에서 강조된다. 또한, 최근에는 식물 세균과는 크게 다르다리스의 합성을위한 경로를 사용하는 것이 발견되었다. 이 발견은 부분적 E. 기능적 보완에 의해 촉진 된 콜라이 디아 미노 (DAP) 모델 식물 애기 장대에서 효소 1,1- 디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)를 코딩하는 유전자를 사용하여 돌연변이.이 중간체 디아 미노 통해리스의 합성 변형 경로가도 1에 도시되어있다. 또 ,리스의 합성 고도로 조절되는 아미노산 아스파르트 유도 패밀리를 통해 용이하게한다. 3 단백질 SYNT의 중요성에 더하여hesis, 티르와 프에 대한 경로는 phenylpropanoid 화합물의 동화에 대한 전구체 화합물로서 자신의 중요성을 같은 식물 방어 화합물의 합성에 관여 주어 강조 표시됩니다 :. 알칼로이드, 리그닌, 플라보노이드, 이소 플라보노이드, 다른 사람의 사이에서 히드 록시 산을 4 티르 및 프 경로는 또한 식물과 박테리아 신진 대사 경로의 차이를 보여주기 위해 강조 표시됩니다. 식물에서 효소 티르 및 프의 이화 작용에 주로 관여 이들 아미노산의 동화 작용에 관여되지 않은 반면, 박테리아, 효소 타이로신 아미노 전이 효소 (TyrB)은 두 아미노산의 동화 작용에 관여한다. (그림 2). (4)
그람 양성 및 그람 펩티도 글리 (PG)의 구조에 대한 음성 세균 사이의 차이는 FPBP 과정에서 강조 표시됩니다. 그람 음성 박테리아의 PG는 사실에 기초한 식물 병리학 관한 관심의 대부분이식물 병원균은 그람 음. 상위 10 세균 피토 – 병원균에 대한 최근 평가는 모든 그램 부정적인 것으로 나타났습니다. 박테리아는 장군으로부터있었습니다. 슈도모나스, Ralstonia, 아그로, 크 산토, 에르 위니아, Xylella, Dickeya 및 Pectobacterium 화학적 차이 5 1 그램 네거티브 및 그람 양성 세균의 PG 줄기 비교 가교 아미노 차이 인 두 가지 유형의 산. PG의 다른 가교의 초기 단계는 PG의 동화의 세포질 단계에서 발생하고 효소은 UDP N -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 아제에 의해 촉진된다 (무레) (그림 3A). 무레 대부분의 그람 음성 세균에서, 펩티드 줄기 번째 위치.도 6에서, 특정 디아민 화합물의 첨가 반응을 촉매, 끝에서 두 번째는리스 (메소 -diaminopimelate을 전구체 <em은> m의 -DAP)의 역할 가교 아미노산 LYS 것은 대부분의 그람 양성균의 PG (도 3B)에서 동일한 역할 역할을한다. (7)이 m의 -DAP 및 LYS 모두 두 아민을 가지고 있다는 사실에 기인 그룹 및 펩타이드 줄기 가교 두 펩티드 결합을 형성 할 수있다.
Bioseparations에서 : 원칙과 사례 (BPP) 과정으로 인해 환경 변화에 박테리아의 배양 방법과 영양 수준 모두 시스템에서 크게 변경됩니다 오픈과 폐쇄 시스템의 차이점은 설명합니다. 이 이벤트는 "아래로 이동"또는 "최대 이동"라고 규정 변경에 링크 된 기아 또는 아미노산 또는 에너지의 적절한 공급에 의해 트리거. 박테리아 문화가 하나의 탄소 소스와 화학적으로 정의 된 매체에 풍부하고 복잡한 매체에서 전송 될 때 "아래로 이동"응답이 발생할 수 있습니다. 환경의 변화는 급속한 cessa에 이르게의 tRNA와 rRNA의 합성 기. 아미노산의 생합성이 상향 조절 되더라도 리보솜 단백질 및 DNA 합성의 부족이 중단 결과.
은 "다운 시프트"반응에 따라, 기존의 변이는 중간 또는 환경에서 더 이상 사용할 수있는 아미노산을 합성하는 신규 효소를 생산하는 데 사용된다. 일정 기간 후, rRNA의 합성 및 새로운 리보솜 조립하고 박테리아 세포의 인구는 감소 속도 비록 성장하기 시작합니다. 사건의 과정은 "엄격한 반응"또는 "엄격한 제어"라고 글로벌 세포 조절의 예이며, 필요한 기질, 에너지 수요의 유용성을 보완하기 위해 셀의 생합성 장치를 조정하기위한 메커니즘으로 생각 될 수있다 . 8 엄격한 반응 따라서 환경의 영양소의 광속에 빠르게 응답하는 세균을 가능 기여 ENH영양소 및 또는 기판의 가용성에 관해서 빠르게 변화 할 수있는 환경에서 경쟁하는 박테리아의 능력을 또한 여러개. 8-9
엄격한 반응은 아미노산, 탄소, 질소, 인산, 및 지방산의 이용이 제한되어 유전자 발현에 필수적인 역할을 갖는다. 8,10-14이 엄격한 응답 개의 뉴클레오티드, 구아노 신 tetraphosphate 포스페이트 (ppGpp) 및 구아노 신으로 배위 pentaphosphate (pppGpp)는 일반적으로 alarmone (P) ppGpp으로 함께 언급했다. 예를 들어, 아미노산이 제한된있는 경우, 구아노 신 3 인산 5 인산의 동화에서 파생 된 구아노 신 3,5- (비스) 피로 인산 포스페이트 (ppGpp)는 (pppGpp)는 축적 단백질 합성 – 더 alarmone의 병목 현상으로 이어질 수 있습니다 셀이다. (p) ppGpp 레벨의 변화는 직접적으로 세포의 성장과 developmen는 관여하는 환경에서 기판의 부족을 극복하기 위하여 반응을 조절하는 유전자의 발현에 관여티. 이 과정에 관여하는 유전자 중 두 RELA 및 지점이라고합니다. RELA 아미노산 제한의 결과 비 대전 된 tRNA의 누적에 대한 반응에 관여하는 리보솜 연결된 (p) ppGpp 합성이다. 관능 성 (P) ppGpp 합성 및 가수 분해 효소 등의 스팟 기능. SPOT의 합성 효소 활성 탄소와 지방산 기아의 부족에 대한 응답에 참여하고있다. RELA / 스팟 동족체는 식물과 박테리아에서 광범위하고 R 영어 / S 냄비 시간 omologs에 대한 RSH라고합니다 8. 8, 10 -12,16 최근 원고 박테리아 Novosphingobium SP는 Rr을 2-17에서 이러한 alarmones 합성에 관여하는 특정 RSH 단백질이 있다는 것을 보여 주었다. 17
여기에서 우리는 기능 보완 분석에 닿는 네 생화학 적 경로를 제시한다. 이 논문에서 설명하는 보완 분석은 EXPL하는 수단을 제공합니다광석 알 / 추정 기능 (들) 또는 티칭 도구 생화학 적 경로의 가르침을 보충하면서 가질 것으로 예상되는 효소를 식별하거나 특징 짓는 수단으로서 본 생체 내 분석을 이용.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술의 로체스터 연구소의 생명 공학 및 분자 생명 과학 교과 과정에 필수적인 과정의 대부분은 과정의 강의 부분에 추가하여 실험실 구성 요소를 가지고있다. 학기 2014에서 2015 사이의 교과 과정은 약 60 %를 차지 실험실 성분을 포함 29있는 48 코스, 총이 포함되어 있습니다. 원칙과 사례 (BPP), 실험실 기초 과정 : 하나의 코스는 식물 생화학 및 병리학 (FPBP), 혼합 강의 / 실험 과정 및 Bioseparations의 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH 및 MAS는 과학의 대학 지원을위한 기술의 로체스터 연구소의 생명 과학의 토마스 H. Gosnell 학교를 인정한다. 이 작품은 미국 국립 과학 재단 (NSF) AOH MCB-1120541에 수상에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
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