يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
آلية متعدية، أي polysome أو polyribosome، هي واحدة من أكبر وأعقد الأجهزة هيولي في الخلايا. Polysomes، التي شكلتها الريبوسومات، من mRNAs، عدة بروتينات والرنا غير الترميز، تمثل منصات حيث تأخذ الضوابط متعدية مكان متكاملة. ومع ذلك، في حين أن الريبوسوم وقد درس على نطاق واسع، وتنظيم polysomes لا تزال تفتقر إلى فهم شامل. وبالتالي مطلوب بذل الكثير من الجهد من أجل توضيح منظمة polysome وأي آلية جديدة للتحكم متعدية التي قد تكون جزءا لا يتجزأ. مجهر القوة الذرية (AFM) هو نوع من المجهر التحقيقي الذي يسمح اقتناء الصور 3D في قرار النانو. مقارنة مع المجهر الإلكتروني التقنيات (EM)، واحدة من المزايا الرئيسية لAFM هو أنه يمكن الحصول على الآلاف من الصور سواء في الهواء وفي حل، مما يتيح للعينة إلى الحفاظ عليها في ظل الظروف الفسيولوجية بالقرب من دون أي حاجة لتلطيخ وتحديد المواليةcedures. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة لتنقية دقيقة من polysomes من دماغ الفأر وترسبها على ركائز الميكا. يتيح هذا البروتوكول التصوير polysome في الهواء والسائل مع فؤاد وإعادة البناء ككائنات ثلاثية الأبعاد. مكملة لالمجهري البرد الإلكترون (البرد م)، والطريقة المقترحة يمكن استخدامها بسهولة لتحليل منهجي polysomes ودراسة منظمتهم.
Introduction
تخليق البروتين هو الأكثر عملية استهلاك الطاقة في الخلايا 1،2. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن الكميات المتوفرة من البروتين يتم التحكم بشكل رئيسي في متعدية بدلا من 3،4،5 مستوى النسخي. وpolysome هو العنصر الجزيئات الأساسي الذي يحول المعلومات مرنا في قراءات البروتينية وظيفية. وبالتالي الاعتراف Polysomes بقدر المجمعات الجزيئات حيث تلتقي عدة ضوابط متعدية 6-13. على الرغم من مئات من الدراسات حول بنية الريبوسوم 14- 16، ورؤى الجزيئية مفصلة في ديناميات الترجمة وطوبولوجيا polysomes واجه الفائدة محدودة. ونتيجة لذلك، وتنظيم الأصلي مجمع polysomal بروتين نووي ريبوزي وتأثيره المحتمل على الترجمة لا تزال القضايا غامضة نوعا ما. Polysomes قد يخفي ما زالت المنظمات أمر وظيفية غير معروفة، ويحتمل أن يعكس ما جسيم نووي وكنترول جينيةوقد مثلت ليرة سورية للمجال النسخ. في الواقع، والتحقيق في هذه الفرضية المثيرة يتطلب دراسات إضافية والنهج التقنية الجديدة. في هذا الخط، وتقنيات الهيكلية ومجهر القوة الذرية قد تعاون مثمر لكشف آليات جديدة للسيطرة على التعبير الجيني، على غرار ما تم تحقيقه لجسيم نووي 17،18.
منذ اكتشاف الريبوسوم 14-16، اتسمت هيكلها على نطاق واسع في بدائيات النوى 19،20، الخميرة 21 ومؤخرا في 22 البشري، وتوفير وصف الجزيئي للآليات على قاعدة من تخليق البروتين. واعترف Polysomes في البداية على غشاء الشبكة الإندوبلازمية، وتشكيل منظمات الهندسية 2D النموذجية 14. كما ذكرت من قبل، لم يكن polysome الجمعية الكائن من الفائدة ثابتة كما بنية الريبوسوم. في الماضي، وقد تم دراسة polysomes أساسا عن طريق آرتقنيات ansmission EM المستندة. إلا في الآونة الأخيرة، مكنت تقنيات البرد EM إعادة الإعمار 3D من polysomes تنقيته من في المختبر أنظمة الترجمة 23-26، لست] الخلوية الإنسان 27 أو في خلايا 28. هذه التقنيات عرضت معلومات أكثر دقة حول تنظيم الريبوسوم الريبوسوم في polysomes 23، 26-28، ووصف الجزيئي الأولي من الأسطح الملامسة للريبوسوم المجاورة في polysomes جنين القمح 24. وهكذا، البرد EM التصوير المقطعي يسمح الكشف عن التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم مع التفاصيل الجزيئية، ولكن مثقلة من قبل مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق وإعادة الإعمار ويحلل التي تتطلب موارد الحسابية الثقيلة من أجل معالجة البيانات. وعلاوة على ذلك، للحصول على التفاصيل الجزيئية من التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم، مطلوب خريطة حل للغاية من الريبوسوم، وهذا النوع من الريبوسوم المرجعي هو متاح فقط لعدد قليل من الأنواع. الأهم من ذلك، البرد EM التصوير المقطعي ليست قادرة على الكشف عن الحمض النووي الريبي مجانا. Therefخام، يطلب من التقنيات الجديدة إلى فهم كامل للتنظيم آلية الترجمة.
بجانب البرد EM، واستخدمت AFM أيضا أداة مفيدة للتصوير المباشر من polysomes في حقيقيات النوى أقل 29-33 والبشر (27). مقارنة EM، AFM لا يتطلب أي تثبيت عينة أو وضع العلامات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء قياسات في الظروف الفسيولوجية القريب ومع إمكانية فريدة للتعرف بشكل واضح على حد سواء الريبوسومات وجدائل الحمض النووي الريبي المجردة 27. تصوير polysomes واحد لا يمكن أن يؤديها بسرعة نسبيا، والحصول على الآلاف من الصور في النانو قرار مع القليل من الجهد مرحلة ما بعد المعالجة بالمقارنة مع مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق والثقيلة وإعادة الإعمار التحليلات المطلوبة بواسطة المجهر البرد EM. ونتيجة لذلك، AFM معالجة البيانات وتحليلها ليست في حاجة محطات العمل باهظة الثمن وقوة الحوسبة عالية. على هذا النحو، فإن هذا الأسلوب يجمع معلومات عن الأشكال polysomal، والخصائص المورفولوجية (مثلارتفاع وطول وعرض)، كثافة الريبوسوم، وجود الحمض النووي الريبي الحرة وعدد من الريبوسومات في polysome 27 مع إنتاجية أعلى من البرد EM. في هذه الطريقة، AFM يمثل طريقة فعالة ومكملة لتقنيات EM لتصوير polysomes 27.
هنا نقدم خط أنابيب الكامل من تنقية لتحليل البيانات حيث يتم تطبيق AFM إلى صورة وتحليل polysomes مخ الفأر. ويركز البروتوكول المقترح حول القضايا تنقية وعلى ترسب دقيقة من polysomes على ركائز الميكا التي تستخدم للتصوير فؤاد. بالإضافة إلى تحليل الجزيئات التقليدية التي يمكن القيام بها بسهولة مع برنامج مشترك يستخدمها المجتمع AFM، المساعد يماغيج 34، ودعا RiboPick، وقدم لحساب عدد من الريبوسومات في polysome 27، 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ثبت بنية الحمض النووي أن تكون ذات أهمية قصوى لوصف عملية النسخ وباعتبارها المنظمة من لونين تفاهمنا السيطرة النسخي التعبير الجيني، فمن الضروري تحليل تنظيم وهيكل polysomes لتحسين الفهم الصادق الترجمة وتنظيمها.
مع بروتوكول وصفها، ف…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
Referências
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Bioquímica. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
