Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
De translatiemachinerie, dwz de polysoomdisplay of polyribosome, is één van de grootste en meest complexe cytoplasmatische machines in cellen. Polysomen, gevormd door ribosomen, mRNA's, een aantal eiwitten en niet-coderende RNA's, vertegenwoordigen geïntegreerde platforms waar de translationele controles plaatsvinden. Echter, terwijl het ribosoom is op grote schaal onderzocht, de organisatie van polysomen ontbreekt nog uitgebreide kennis. veel inspanning is dus noodzakelijk om polysoomdisplays organisatie en elk nieuw mechanisme van translationele controlesignalen die worden ingesloten helderen. Atomic force microscopie (AFM) is een soort van scanning probe microscopie dat de overname van 3D-beelden op nanoschaal resolutie maakt. Vergeleken met elektronenmicroscopie (EM) techniek, een van de belangrijkste voordelen van AFM dat duizenden beelden zowel in lucht en in oplossing te verwerven, zodat het monster onder dichtbij fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd zonder enige noodzaak voor het kleuren en vaststelling proprocedures. Hier is een gedetailleerd protocol voor de zuivering van nauwkeurig polysomen van muizenhersenen en hun depositie op substraten mica beschreven. Dit protocol maakt polysoomdisplays beeldvorming in lucht en vloeistof met AFM en de wederopbouw driedimensionale objecten. Complementair aan cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), kan de voorgestelde methode gemakkelijk worden gebruikt voor het systematisch analyseren polysomen en het bestuderen van hun organisatie.
Introduction
De synthese van eiwitten is de meeste energie verbruikende proces cellen 1,2. Daarom is het niet verwonderlijk dat eiwit abundanties voornamelijk gecontroleerd op de translatie in plaats van transcriptie niveau 3,4,5. De polysoom is de fundamentele macromoleculaire component die de mRNA informatie in functionele eiwitachtige uitlezingen omgezet. Polysomen zijn tot nu toe beschouwd als macromoleculaire complexen waar verschillende translationele controles samenkomen 6-13. Ondanks honderden studies over ribosoom structuur 14- 16, heeft de gedetailleerde moleculaire inzicht in de dynamiek van de vertaling en de topologie van polysomen een beperkt belang aangetroffen. Als gevolg daarvan, de organisatie van de inheemse polysomale ribonucleoproteïne complex en de mogelijke gevolgen daarvan voor vertalingen zijn nog vrij onduidelijk kwesties. Polysomen kan nog onbekend besteld en functionele organisaties verbergen, potentieel spiegelen wat nucleosomen en epigenetische controls zijn vertegenwoordigd voor het veld transcriptie. Uit het onderzoek van deze intrigerende hypothese vereist bijkomende studies en nieuwe technische benaderingen. In deze lijn, kunnen structurele technieken en atomic force microscopy vruchtbaar samenwerken om nieuwe mechanismen ontrafelen voor de controle van genexpressie, vergelijkbaar met wat werd bereikt voor de nucleosoom 17,18.
Sinds de ontdekking van het ribosoom 14-16, is de structuur uitgebreid gekarakteriseerd in prokaryoten 19,20, gist 21 en meer recent in humane 22, die de moleculaire beschrijving van de mechanismen die aan de basis van eiwitsynthese. Polysomen werden initieel opgenomen op het membraan van het endoplasmatisch reticulum, de vorming van typische 2D geometrische organisaties 14. Zoals eerder vermeld, heeft polysoomdisplay montage niet vatbaar constante belang als ribosoomstructuur geweest. In het verleden zijn polysomen werden voornamelijk bestudeerd door transmission EM-gebaseerde technieken. Pas onlangs, cryo-EM technieken kon de 3D-reconstructie van gezuiverd polysomen van in vitro translatie-systemen 23-26, menselijke cellulaire lysaten 27 of in cellen 28. Deze technieken bood meer verfijnde informatie over de ribosoom-ribosoom organisatie polysomen 23, 26-28 en een eerste moleculaire beschrijving van de contactoppervlakken van aangrenzende ribosomen in tarwekiemen polysomen 24. Zo cryo-EM tomografie maakt de openbaarmaking van ribosoom-ribosoom interacties met moleculaire detail, maar het wordt belast door uitgebreide post-processing en wederopbouw analyses die zware computationele middelen nodig voor gegevensverwerking. Bovendien zou de moleculaire details van ribosoom-ribosoom interacties te verkrijgen, een hoogst vastbesloten kaart van het ribosoom vereist en dergelijke referentie ribosoom is alleen beschikbaar voor enkele soorten. Belangrijk is cryo-EM tomografie is niet in staat om gratis RNA te detecteren. Thereferts worden nieuwe technieken die nodig zijn om de organisatie van de vertaling machines volledig te begrijpen.
Naast cryo-EM, is de AFM is ook gebruikt als een nuttig hulpmiddel voor directe beeldvorming van polysomen in lagere eukaryoten 29-33 en mensen 27. Vergeleken met EM, AFM vereist geen monster fixatie of de etikettering. Bovendien kunnen metingen worden uitgevoerd in de buurt van fysiologische omstandigheden en met de unieke mogelijkheid om duidelijk te identificeren zowel ribosomen en naakt RNA strengen 27 uitgevoerd. Beeldvorming van enkele polysomen kan relatief snel worden uitgevoerd, het verkrijgen van duizenden beelden op nano-resolutie met weinig post-processing inspanning in vergelijking met de uitgebreide en zware post-processing en wederopbouw analyses vereist door cryo-EM microscopie. Consequently, AFM data verwerking en analyse niet duur werkstations en hoge rekenkracht nodig hebben. Als zodanig is deze techniek verzamelt informatie over polysomale uniek morfologische kenmerken (zoalshoogte, lengte en breedte), ribosoom dichtheden is de aanwezigheid van vrije RNA en het aantal ribosomen per polysoomdisplays 27 met een hoger debiet dan cryo-EM. In een dergelijke manier, AFM staat voor een krachtige en complementaire aanpak van EM technieken om polysomen 27 portretteren.
Hier presenteren we een volledige pijpleiding van zuivering tot data-analyse, waar AFM wordt toegepast op de afbeelding en analyseren muizenhersenen polysomen. De voorgestelde protocol gericht op zuivering kwesties en de nauwkeurige afzetting van polysomen op mica substraten die worden gebruikt voor AFM beeldvorming. In aanvulling op de conventionele analyse van deeltjes die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd met gangbare software wordt gebruikt door de AFM gemeenschap, een ImageJ 34 plugin, genaamd RiboPick, wordt gepresenteerd voor het tellen van het aantal ribosomen per polysoomdisplays 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
De structuur van DNA werd bewezen van cruciaal belang voor het proces van transcriptie en de organisatie van de chromatinestructuur geavanceerde ons begrip van transcriptionele regulatie van genexpressie te beschrijven, is het essentieel om de organisatie en structuur van polysomen analyseren de waarheidsgetrouwe begrip verbeteren van de vertaling en de regelgeving.
Met de beschreven protocol, een optimale dichtheid van polysomen zacht geïmmobiliseerd op een vlak oppervlak, geschikt voor AF…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
Referências
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Bioquímica. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
