Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes 1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o difícil de detectar mudanças sutis na expressão gênica que em última análise, propor decisões destino celular 3. De modo semelhante, um único tipo de célula pode ter diferentes perfis de expressão, em resposta ao microambiente 4. Por exemplo, células endoteliais residentes no mesmo órgão ou em diferentes órgãos (por exemplo., Aorta ou renal) exibem uma heterogeneidade significativa apesar de compartilhar MORP comumhological e funcionais características 5. Além disso, as células cancerosas que povoam o mesmo tumor também podem ter diferentes perfis moleculares ou mutações ao nível da célula individual 6.
Em sistemas modelo, transcriptomics em células individuais identificou com sucesso novas populações de células, caracterizado estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular, e revelou respostas celulares diferenciais aos estímulos 7,8,9. Tais percepções teriam sido detectáveis em estudos de base populacional convencionais. embriões de peixe-zebra são uma fonte tremendamente subutilizado do caule, progenitor, e as células de diferenciação para explorar questões de heterogeneidade célula única e regulação molecular de identidades celulares durante o desenvolvimento. Sua, ex vivo desenvolvimento e facilidade de manipulação genética altamente estereotipados torná-los um sistema modelo excelente para esta abordagem 10,11. Especificamente, uma grande limitação para a interpretação de uma única célula gendados e expressão é que a identificação fiável de novos estados de células intermediárias durante o desenvolvimento exige um timing muito cuidado de coleta de tecido 9. Isto é necessário para assegurar que a heterogeneidade entre as células capturadas representa heterogeneidade dentro de um tecido a um único ponto de tempo, em vez de heterogeneidade na expressão de genes apresentada pela diferenciação celular dependente da idade. Em comparação com ratos, o desenvolvimento do embrião de peixe-zebra podem ser precisamente sincronizados através de um grande número de embriões 12. Além disso, com os tamanhos grandes de embraiagem, os embriões de peixe-zebra pode ser usado como uma fonte abundante de células estaminais e progenitoras.
Este protocolo descreve um método para isolar a partir de embriões de peixe-zebra células e capturar as células individuais utilizando um sistema de chip e Autoprep disponível comercialmente circuito microfluidos integrado (IFC) para análise da expressão do gene qRT-PCR. Este protocolo pode ser rapidamente transferível para quaisquer ensaios de alto rendimento de multiplexagem, incluindo todasequenciamento do transcriptoma que permite a análise mais abrangente da heterogeneidade celular 13. Também oferece várias vantagens para ensaios de expressão de gene tradicionais. O protocolo de isolamento de células individuais produz alta viabilidade depois de FACS, o que diminui a proporção de células comprometidas que são incluídos em aplicações a jusante. Usando um IFC, as células capturadas pode ser observado diretamente para avaliar as taxas de captura e avaliar a saúde das células morfologicamente. Além disso, este protocolo é amplamente aplicável para a comunidade científica peixe-zebra, necessitando apenas de uma linha de peixes transgénicos marcado e acesso às tecnologias de captura de células microfluídicos.
Como prova de princípio, células únicas derivadas de progenitores cardíacas foram isoladas e capturado num chip IFC, e, em seguida, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi medida por qRT-PCR. Análise da expressão de genes ao nível da célula individual demonstra que células progenitoras cardíacas coexistir com a sua diferenprogênie ntiating. O conhecimento adquirido a partir de perfis de uma única célula de células progenitoras cardíacas podem lançar luz sobre a heterogeneidade nos padrões de expressão gênica entre células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento dos vertebrados, que pode ter sido mascarado nas análises tradicionais de base populacional.
Protocol
Representative Results
Discussion
O processo aqui descrito utiliza, a expressão de uma proteína fluorescente sob o controlo de um promotor específico do tipo de célula para enriquecer uma população de células progenitoras cardíacas a partir de embriões de peixes-zebra para o uso no sistema de captura de uma única célula assistida de microfluidos para avaliar a expressão de um subconjunto de genes cardíacos em única células. Desde que FACS de excitação e de emissão de laser capacidades são compatíveis com o fluoróforo (s) de escolha,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
Referências
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
