Un Tessuto 3D combinata Engineered<em> In Vitro</em> /<em> In Silico</em> Polmone tumore per predire l'efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
Nel presente studio, abbiamo combinato un 3D polmone modello in vitro tumore con un modello in silico per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di uno specifico background mutazionale. Il modello è generato su un ponteggio suina decellularized che riproduce le caratteristiche tessuto-specifici per quanto riguarda la composizione della matrice extracellulare e l'architettura tra cui la membrana basale. Abbiamo standardizzato un protocollo che permette la generazione di tessuto tumorale artificiale entro 14 giorni di cui tre giorni di trattamento farmacologico. Il nostro articolo fornisce diversi descrizioni dettagliate di 3D lettura le tecniche di screening, come la determinazione del indice di proliferazione Ki67 colorazione, l'apoptosi da surnatanti da M30-ELISA e la valutazione dei epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), che sono strumenti utili per valutare l'efficacia delle composti terapeutici. Abbiamo potuto dimostrare rispetto alla cultura 2D una riduzione della proliferazione nel nostro modello di tumore in 3D che è relatcato alla situazione clinica. Nonostante questa proliferazione più bassa, il modello previsto EGFR risposte farmacologiche -targeted correttamente in base allo stato biomarker come dimostra il confronto delle linee cellulari di carcinoma del polmone HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) e A549 (EGFR wild-type, KRAS – mutato) trattati con il gefitinib inibitore della tirosin-chinasi (TKI). Per studiare le risposte farmacologiche di cellule tumorali più avanzate, abbiamo indotto EMT da un trattamento a lungo termine con TGF-beta-1 come valutato dal vimentina / immunofluorescenza pan-citocheratina. Un flusso-bioreattore è stato impiegato per regolare la cultura a condizioni fisiologiche, che ha migliorato la generazione dei tessuti. Inoltre, mostriamo l'integrazione di risposta ai farmaci in seguito al trattamento con Gefitinib o TGF-beta-1 stimolazione – apoptosi, indice di proliferazione e EMT – in un valore booleano nel modello di silico. Inoltre, spieghiamo le risposte come farmaco di cellule tumorali con uno specifico background mutazionale e conteggioerstrategies contro la resistenza possono essere previsti. Siamo sicuri che il nostro 3D nell'approccio vitro in particolare con la sua espansione in silico fornisce un valore aggiunto per il test anti-droga preclinica in condizioni più realistiche che in coltura cellulare 2D.
Introduction
L'industria farmaceutica sta affrontando alti tassi di attrito fino al 95% nel campo del trattamento del cancro in fase clinica causando costi enormi 1-5. Una ragione di questo deficit è il fatto che attualmente efficacia di potenziali nuovi composti è valutata in screening su larga scala su colture cellulari 2D su linee cellulari di cancro o in modelli animali. I modelli animali hanno una maggiore complessità, ma ci sono differenze cruciali tra i topi e gli uomini 6,7. Negli ultimi dieci anni, modelli di cancro 3D utilizzando diversi approcci sono stati generati per colmare il divario tra la cultura 2D delle linee di cellule di cancro e di un complesso 6,8,9 vivo del tumore. L'impatto ambientale 3D sulla differenziazione cellulare e anche sul segnale è stato dimostrato in diversi studi anni fa (ad es., Da Mina Bissell) 10,11. Oggi, molti modelli di coltura cellulare 3D sono disponibili, come le culture sferoide, idrogeli o chip microfluidica 12-16. Anche se These modelli migliorano la complessità rispetto ai sistemi di coltura convenzionale 2D, la maggior parte essi mancano di un microambiente tessuto che è noto per avere effetti tumorali di supporto e anche gli impatti efficacia del farmaco.
Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di tumore 3D basata su una impalcatura biologica chiamato SISmuc (piccolo intestino-sottomucosa + mucosa) che è derivato da un digiuno suina decellularized. In tal modo, l'architettura dei tessuti e importanti componenti della ECM come diversi collageni nonché la struttura membrana basale sono conservati 17. Questa caratteristica unica è fondamentale per la generazione modello di tumore di carcinomi che derivano da epiteli e costituiscono circa l'80% dei tumori solidi. Inoltre, il tasso di proliferazione nel nostro modello di tumore tissutale è ridotta rispetto ai tassi artificialmente elevati raggiunti nella cultura 2D. Come proliferazione è un parametro importante per valutare l'efficacia dei farmaci, droga test è abilitato nel nostro modello più similecondizioni per in vivo Tumori 17.
Al fine di valutare il potenziale del nostro modello per prevedere biomarcatore-dipendente efficacia dei farmaci correttamente, i dati qui presenti per due diverse linee di cellule di cancro al polmone che si differenziano per il loro stato di EGFR -biomarker. Questo stato mutazionale ha iniziato ad essere determinato di routine in pazienti con NSCLC. Trattamenti mirati con TKIs come l'EGFR, inibitore della gefitinib contro i tumori recanti un attivando mutazione dell'EGFR mostrano risultati superiori rispetto a quelli con la chemioterapia a base di platino 18-21.
Abbiamo stabilito diverse tecniche di read-out che sono rilevanti per la valutazione dell'efficacia composto. Inoltre, dopo il TGF-beta-1 stimolazione siamo in grado di indagare le azioni composti nelle cellule tumorali che hanno iniziato il processo di EMT, che è pensato per essere un passo importante nella trasformazione maligna 22,23 e che è collegato a resistan di drogace 24.
Il modello di tumore 3D consentire il monitoraggio delle risposte specifiche delle celle a trattamenti mirati, la chemioterapia, o combinazioni di farmaci con buoni contrasti. Per migliorare ulteriormente e velocizzare droga screening e ad incontrare resistenza, è completato da una simulazione in silico. Sulla base di alcuni esperimenti, la risposta tumorale può essere previsto in silico per quanto riguarda il risultato per una gamma completa di farmaci e loro combinazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo stabilito un combinato in vitro / in sistema di prova del tumore silico per le previsioni di trattamento biomarker-guidata. Il modello in vitro valuta diversi aspetti importanti azioni composti come cambiamenti di proliferazione delle cellule tumorali e apoptosi su una determinata sfondo mutazionale che possono anche essere simulati in silico 17. Qui, vi presentiamo il protocollo standardizzato per la generazione di modello di tumore 3D e test composti compresa la q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sponsorizzata dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF, concessione BD247) dell'Ospedale dell'Università di Wuerzburg e il programma Bayern Fit (concesso a Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
Referências
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