Abstract
Рассеянный склероз, как предполагают, воспалительное аутоиммунное заболевание, которое характеризуется образованием поражения центральной нервной системы (ЦНС), что приводит к когнитивной и двигательных нарушений. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является полезной животной моделью MS, так как он также характеризуется образованием поражением ЦНС, нарушение двигательной и также определяется аутоиммунных и воспалительных реакций. Одна из моделей EAE индуцируют с пептидом , полученным из миелин олигодендроцитов белка (MOG) 35-55 у мышей. Мыши EAE разработать прогрессивное течение заболевания. Этот курс делится на три фазы: доклинические фазы (день 0 - 9), начало заболевания (день 10 - 11) и острой фазы (день 12 - 14). МС и ЕАЕ индуцируются аутореактивных Т-клеток, которые проникают в ЦНС. Эти Т-клетки секретируют хемокины и цитокины, которые приводят к набору дополнительных иммунных клеток. Таким образом, распределение иммунных клеток в спинном мозге Dйти во время трех фаз заболевания была исследована. Для того, чтобы выделить момент времени болезни, при которой начинается активация / пролиферации / накопление Т-клеток, В-клеток и моноцитов, распределение иммунных клеток в лимфатических узлах, селезенке и крови также оценивали. Кроме того, уровни ряда цитокинов (IL-1 & beta;, IL-6, IL-23, TNF-alpha, IFN & gamma;) в трех фазах заболевания были определены, чтобы получить представление о воспалительных процессах заболевания. В заключение отметим, что данные обеспечивают обзор функционального профиля иммунных клеток в процессе EAE патологии.
Introduction
Рассеянный склероз (РС) и соответствующая модель животного, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), показывают, аутоиммунные изменения нейровоспаления в центральной нервной системе (ЦНС). Ранние активные поражения MS и EAE характеризуются наличием проникших иммунных клеток. Этиология МС остается неизвестным, но широко считается вовлечь разрушение миелина, опосредованного аутореактивных Т-клеток. Эти аутореактивные Т-клетки секретируют провоспалительные цитокины и хемокины, которые привлекают другие иммунные клетки, такие как В-клетки, моноциты и нейтрофилы из кровообращения. Моноциты дифференцируются в макрофаги. Интерферон гамма (IFN & gamma;), секретируемые аутореактивного Т-клетки поляризует макрофаги в текущем провоспалительных макрофагов. Провоспалительных макрофаги высвобождения цитокинов и активных форм кислорода, которые способствуют апоптозу в олигодендроциты. Смерть олигодендроцитов приводит к демиелинизации. Кроме того, В-клетки дифференцировались в рКлетки Lāsma и высвобождения аутоантитела против миелиновой оболочки, в конечном счете, приводит к ухудшению миелина. Потеря миелина приводит к деградации аксонов и нейронов и тем самым к образованию участков поражения в ЦНС , которые представляют собой основную характеристику МС 1. На периферии, Т-клетки и В-клетки активируются в лимфатических узлах, они пролиферируют в селезенке и мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему. Моноциты и нейтрофилы пролиферировать в костном мозге, а также мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему.
Лейкоцитов из костного мозга, селезенки и лимфатических узлов в кровь или из кровотока в ЦНС является многоэтапный процесс, который зависит от нескольких факторов, в том числе молекулярных взаимодействий между лейкоцитами и эндотелием, опосредованных хемокинов и рецепторов хемокинов. Производство хемокинов различными типами клеток могут быть вызваны во время иммунной reactioN цитокинами , такими как фактор некроза опухоли альфа (ФНО), IFN & gamma ; и интерлейкина-6 (ИЛ-6), который впоследствии вербует иммунные клетки к месту воспаления 2,3. Иммунные клетки представляют подмножество рецепторов хемокинов на их поверхности, в зависимости от типа клеток и пути миграции в воспаленном участке. Таким образом, CXCR2, CCR1 и CXCR1 экспрессируются на зрелых нейтрофилов в костном мозге и крови 4, и связывание его лигандов, CXCL2, CCL5 или CXCL6, соответственно, активирует нейтрофилы и способствует их адгезии к эндотелию и в дальнейшем, миграцию клеток в ткани 5-9. CCL2 и CCL20 привлекают моноциты и клетки Th1 / Th17 10, которые выражают CCR2 11 и CCR6 12, соответственно. CCR1 и CCR5, выраженное различными типами клеток, включая Т - клетки, моноциты и макрофаги 13, связывают CCL3, CCL5 и CCL7 и усиливает свою активность во время МС 14. CXCR3 экспрессируется на Т-клетках и связывает CCL9, CCL10 иCCL11 15.
Одной из основных стратегия лечения рассеянного склероза является истощение иммунных клеток или предотвращение инфильтрации клеток иммунной в ЦНС. Таким образом, блокада специфических рецепторов хемокинов было исследовано в EAE. Антагонизм или генетическое удаление CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 или CXCR2 19 уменьшает EAE патологии, в то время как антагонизм или генетического удаления CCR1 20, 20 CCR5 или CXCR3 21 не снижали патологии. Следовательно, экспрессия специфических рецепторов хемокинов на лейкоцитах является решающим для проникновения последнего в ЦНС и диктует ход EAE.
Истощение иммунных клеток является эффективной стратегией для лечения пациентов с рассеянным склерозом, так как внедренные иммунные клетки высвобождают цитокины, такие как TNF & alpha ; , IL-6 и IL-1 , который, в свою очередь, способствуют воспалительного процесса или деградацию нейронов 22. Кроме того, ав-реактивные Th1-клетки, релиз IFN & gamma; в свою очередь, стимулирует макрофаги к выпуску TNF-alpha, IL-1 & beta; и IL-23.
Эта рукопись описывает индукцию ЭАЭ, определения распределения иммунных клеток и уровни цитокинов (мРНК) в различных тканях у мышей EAE. Клетки были выделены в различные моменты времени в течение болезни, чтобы обеспечить обзор воспалительных процессов, которые в конце концов приводят к образованию поражений в ЦНС зависит от времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Наши экспериментальные процедуры одобрены Комитетом по этике Regierungspräsidium Дармштадт (Германия) по и подтвердить к национальным и европейским нормам. Все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания животных и уменьшить количество используемых животных.
1. EAE модель
- Индукция модели EAE
- Используйте 10- до 13-недельного возраста самка 129S4 мышей / SvJae × C57BL / 6 для индукции EAE.
- Дайте Мышей подкожную инъекцию, в верхней и нижней части спины, на энцефалитогенных МОГ 35 - 55 (миелин олигодендроцитов гликопротеин) пептида (200 мкг), эмульгированного в 200 мкл полной Freund`s адъювантной (CFA) , содержащей 400 мкг микобактерии туберкулеза.
Примечание: В качестве отрицательного, немедицинские индуцирующего контроля мнимого, неполный адъювант Фрейнда , содержащий микобактерии туберкулеза, в том же объеме и по тому же маршруту, могут быть использованы. - Thereafter, и снова 24 часа позже, дают Мышам внутрибрюшинно инъекцию коклюшного токсина (всего 0,2 мкг, разведенного в 200 мкл фосфатно-буферным солевым раствором PBS). Использование необработанных мышей в качестве контрольной группы, чтобы иметь возможность сравнить больное со здоровыми животными.
Примечание: Кроме того , можно индуцировать EAE с 200 - 300 мкг MOG 35 - 55 пептида, 300 - 500 мкг микобактерий туберкулеза в CFA и 0,2 - 0,3 мкг коклюшного токсина в объеме 0,1 - 0,2 мл на инъекцию. - Начиная через одну неделю после инъекции мышам ежедневно EXAMINE для клинических симптомов (см шаг 1.2.1)
Примечание: В день начала болезни варьирует в различных экспериментах, но в условиях, в нашей лаборатории, это около 11-й день и, таким образом, здесь день 14 определяется как через 3 дня после начала заболевания. У всех мышей в данном исследовании разработаны клинические симптомы.
- Скоринг мышей
- Классифицировать клинические симптомы клинической оценки следующим образом:0) Нет признаков, 0,5) дистальный паралич хвоста, 1) полный паралич хвоста, 1,5) хромать хвост и мягкий слабость задних ног, 2) хромать хвост и сильная слабость задних ног, 2,5) хромать хвост и паралич одна задняя нога, 3) хромать хвост и паралич обеих задних конечностей, 3,5) паралич обеих задних конечностей и слабость одной передней конечности (мыши достигающие этот счет были подвергнуты эвтаназии, в соответствии с местными этическими нормами).
2. Получение одиночных клеток для анализа потока цитометрии
Примечание: Смесь антитело состоит из 1 мкл CD45-Vioblue, 2 мкл CD8-eFluor650, 0,5 мкл CD11b-eFluor605, 0,5 мкл F4 / 80-PE-Cy7, 1 мкл CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 мкл CD11c -AlexaFluor700, 1 мкл CD19-APC-H7 и 1 мкл Ly6G-APC-Cy7.
Примечание: Если вы берете кровь, лимфатические узлы, селезенка и спинного мозга, то процедура выглядит следующим образом: Мыши глубоко анестезию комбинацией isoflurane (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела). Затем откройте грудную клетку, удалить кровь с внутрисердечной палкой и заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS. Затем удалите лимфатические узлы с последующим селезенке и, наконец, спинной мозг. Если вам не нужно заливать мышей внутрисердечно затем усыпить мышей под глубокой анестезией вывих шеи.
- Выделение спленоцитов
- Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
- Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта, чтобы избежать каких-либо загрязнений с волосками и открыть грудной клетки в продольном направлении, не прокалывая глубокие ткани, с помощью ножниц.
- Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
Примечание: Селезенка расположена в левой верхней абдоминальной квадранте под грудной клеткой. Если только селезенку изучаться, этот орган может быть удален перед перфузией для того, чтобы Retaiп все типы клеток, представляющих интерес. - Удалить селезенку и отрезать примерно 1/8 и взвесить его. Храните образец в PBS на льду.
- Сжать ткань селезенки через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), с помощью плунжера 2 мл шприца.
- Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 1800 мкг в течение 3 мин. Ресуспендируют осадок в 500 мкл раствора лизиса.
Примечание: На этом этапе, может быть необходимо, чтобы сделать рассчитывать дифференциальный клетка, если, позже, альтернативный метод анализа FACS используется, который не использует бусинки (смотри раздел 3). - Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре (RT).
- Повторите этап промывки с 500 мкл PBS. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / PBS, добавляют 2 мкл Fc-рецептора-1 (FcRI) блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 13 мклtibody смесь, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавьте 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант.
Примечание: Процедура окрашивания производителя рекомендует единую стирку, но дополнительное снижение фонового окрашивания может быть достигнуто за счет необходимости повторение стадии отмывки больше один или два раза. - Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS (или, возможно, работает буфер для разделения белков, чтобы потенциально уменьшить клеток комков) и передать его в проточной цитометрии трубки. Сохранить клетки на льду.
- Выделение клеток лимфоузлов
- Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
- Влажные Разрез область с 80% изопропилового спирта и открыть грудную клетку в продольном направлении с помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
- Для того, чтобы изолировать паховый лимфатический узел, осторожно снимите кожу в области Hiр и выбрать лимфатический узел тщательно из жировой ткани с щипцами. Взвесьте паховый лимфатический узел и хранить образцы в PBS на льду.
Примечание: Мы использовали паховые лимфатические узлы в наших исследованиях , так как О'Коннор и др. обнаружили , что большое число активированных моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и Т - клеток , были все присутствующие в паховых лимфатических узлах после индукции ЕАЕ 24. - Сожмите лимфоузел через сито 70 мкм (расположенную над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
- Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 2400 мкг в течение 8 мин. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать егок проточной цитометрии трубки.
- Выделение клеток крови
- Добавить 50 мкл 20 мМ HEPES до 50 мкл крови (стабилизированный с ЭДТА) и добавляют 500 мкл раствора Lysing. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите стадию промывки.
- Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS и передачи его в проточной цитометрии трубки.
- Выделение клеток спинного мозга
- Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
- Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта и открыть грудной клетки в продольном направлениис помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
- Влажные области надреза на спине и сделать снова продольный разрез скальпелем и снимите кожу.
- Вырежьте поясничного отдела позвоночника (который иннервирует задние конечности) и промойте его с PBS заполненный шприц для извлечения спинного мозга. Вырез примерно 1/3 поясничном шнура, весить это и хранить образцы в PBS на льду.
- Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, добавляют 500 мкл раствора открепления клеток и HBSS (1: 1). Добавить 3 мг / мл коллагеназы А и 1 ед / мл ДНКазы I, разрывать клетки путем неоднократного вверх и вниз пипеткой и инкубировать в течение 30 мин при встряхивании при 37 ° C при 400 оборотах в минуту.
Примечание: При желании суспензию клеток может быть очищен от загрязняющего миелина и клеточных остатков центрифугирования в градиенте плотности, которые могут улучшить чувствительность проточной цитометрии измерения, таким образом, уменьшая фон автофлюоресценции А.Н.d число событий, которые должны быть приобретены (смотри раздел 3.5). - Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок в 1 мл 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) / минимальная поддерживающая среда Дульбекко (DMEM), и разрывать клетки снова многократным вверх и вниз пипеткой.
- Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл PBS и сжимают спинной мозг через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
- Промойте сетку с 4 мл PBS. Центрифуга при 1,800 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующий реагент и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
- Удалите супернатант, ресуспендируют Pelle клетокт в 500 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать его на поточной цитометрии трубки.
3. Cytometric анализ потока
- Titrate все антитела заранее , чтобы определить оптимальные концентрации , как описано Olesch и др. 25.
- Использование антител захвата компенсации шарики для компенсации одноцветной для создания многоцветных матриц компенсации в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Контроль калибровки прибора ежедневно, используя специальные шарики в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Непосредственно перед проточной цитометрии измерения, добавьте 30 мкл проточной цитометрии абсолютного количества стандарта к клеткам (для изоляции смотри раздел 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) для определения абсолютного количества клеток. Вместо того чтобы использовать подсчета бусинки клетки могут быть подсчитаны.
- Возьмите образцы (клетки из селезенки, лимфатических узлов и крови: 100000 событий, спинного мозга: 500000 событий) в проточном цитометрей анализ с помощью специального программного обеспечения цитометрии потока.
- Откройте программное обеспечение проточной цитометрии и добавьте FCS 3.0 файлы, нажав на кнопку "добавить образцы".
- Откройте файл добавлен двойным щелчком. Настройте каналы для х- и у-оси. Для выбора популяции клеток , представляющих интерес создать ворота (смотри рисунок 4).
4. Количественный ПЦР анализ
- Выделение мРНК и транскрипции в кДНК
- Извлечение мРНК из поясничного отдела спинного мозга (1/3), селезенка (1/8) и паховых лимфатических узлов с помощью фенол-хлороформом и осаждают этанолом 26.
- Для этого, гомогенизацию ткани в 1 мл гуанидин тиоцианат-фенол смеси инкубируют в течение 10 мин. Добавить 200 мкл хлороформа и инкубировать в течение 10 мин.
- После центрифугирования (18 000 мкг в течение 15 мин при температуре 4 ° С), промывать верхнюю водную фазу с помощью 500 мкл изопропанола и центрифугу (18.000 х г в течение 8 мин при 4° С).
- Промывают осадок 500 мкл этанола и после стадии центрифугирования (18 000 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С), сухой осадок в вакуумной концентратором (5 мин при 30 ° С). После этого, ресуспендируют осадок в 30 мкл воды.
- Для извлечения мРНК из крови, центрифуга 500 мкл ЭДТА-стабилизированной крови (300 мкг в 10 мин 4 ° С).
- Возьмем поглощающее покрытие, содержащая белые клетки крови, и разбавить в 1 мл лизирующего раствора (150 мМ NH 4 Cl, 100 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ Na-ЭДТА , рН 7,4).
- После 10 мин инкубации при комнатной температуре, центрифугировать клетки при 650 х г в течение 6 минут, а затем промыть в два раза с PBS.
- Извлечение мРНК из белых кровяных телец (WBCs) с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните синтез кДНК с использованием набора для синтеза кДНК в том числе случайных гексамерах в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте 200 нг мРНК для CdnСинтез.
- Извлечение мРНК из поясничного отдела спинного мозга (1/3), селезенка (1/8) и паховых лимфатических узлов с помощью фенол-хлороформом и осаждают этанолом 26.
- Количественная ПЦР
- Для количественной оценки количества специфической мРНК, используют 1 мкл кДНК, 1 мкМ вперед / назад праймера и флуоресцентный краситель ДНК связывания в соответствии с инструкциями изготовителя 27. Приведены в таблице 1 для последовательностей для наборов праймеров. Мера CT-значения IL-1, IL-6, IL-23, IFN & gamma;, TNF-alpha и PPIA (пептидил-пролил-изомеразы) с использованием системы количественного ПЦР.
- Для определения экспрессии мРНК по сравнению с помощью метода 27 сравнительный CT (пороговый цикл).
- Для этого, нормализовать CT-значения генов - мишеней на уровни экспрессии PPIA путем вычитания среднего CT-значение PPIA от гена - мишени, как описано в предыдущих исследованиях (Barthelmes и др. 28, Шиффманна и др. 29, Шиффманна и др. 30). Впоследствии, вычислить так называемые ΔΔCT-значения, с помощью которых, нормализовать значения & Delta; CТ-генов-мишеней от мышей EAE до уровня экспрессии генов-мишеней необработанных мышей, снова путем вычитания среднего & Delta; CТ-значение в необработанных мышей от & Delta; CТ-значения у мышей EAE.
- Для того, чтобы получить относительный уровень экспрессии мРНК гена - мишени, вычислить отношение с помощью следующей формулы: 2 - ΔΔct.
- Проверьте специфичность каждого праймера. Определить усиленную размер фрагмента , используя агарозном геле 2% 31. Размер фрагмента показана в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 приведен схематический обзор различных способов , описанных в этой статье. 1) Мыши получали инъекцию MOG 35-55 антигена и развить начальные клинические симптомы после 10,7 ± 0,3 дней 28. Представитель Конечно болезнь EAE мышей показано на рисунке 1. 2) Различные ткани (селезенка, лимфатические узлы, поясничного спинного мозга) и крови извлекаются из контрольных и ЕАЕ мышей в различные моменты времени в течение доклинической стадии (2 -й день, 4 -й день , день 6), во время начала заболевания (день 10) и во время острой фазы заболевания (12 -й день, 14 -й день). 3) мРНК профиля экспрессии цитокинов, которые регулируют развитие EAE, определяется в различных ткани извлеченный в различные моменты времени в течение болезни, с помощью количественной ПЦР. 4) Отдельные клетки выделяют из различных тканей , экстрагированныхв различные моменты времени в течение заболевания и распределения иммунных клеток определяли с помощью проточной цитометрии.
В селезенке и лимфатических узлах, Т-клетки и В-клетки наблюдаются как тип наиболее известных клеток. В отличие от лимфатических узлов, в селезенке, кроме того, большое количество моноцитов и нейтрофилов присутствуют. Все иммунные клетки обнаруживают кратковременное повышение лимфатических узлов во время острой фазы, в то время как только макрофаги, В-клетки, Т-клетки и нейтрофилы увеличение селезенки. В крови, все клетки иммунной системы увеличивают скоротечно в течение доклинической фазе. В поясничного отдела спинного мозга, болезнь-зависимый рост всех иммунных клеток наблюдается, кроме моноцитов, которые , предположительно , дифференцируются в макрофаги после их входа в спинной мозг (рисунок 2). CD4 + и CD8 + Т - клетки показывают сопоставимые изменения в селезенке, лимфатических узлах и крови во время различных курсов болезни. AmOng клетки проникают в спинной мозг, увеличение CD4 + Т - клеток была наиболее выражена (рисунок 3). На рисунке 4, стробирование-стратегия для определения различных клеточных популяций показано. Более подробно, клеточные популяции, описанные в этой рукописи были определены следующим образом: моноциты (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), макрофаги (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), нейтрофилы (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), дендритные клетки (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), В-клетки (CD45hi, CD3-, CD19 +), Т-клетки (CD45hi, CD3 +) , CD4 + Т-клетки (CD45hi, CD3 +, CD4 +) и CD8 + Т-клетки (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Число клеток связаны с количеством ткани (вес селезенки, лимфатических узлов, поясничного отдела спинного мозга) или объема крови, таким образом, что отражает абсолютное количество клеток. Это, однако, можно выразить типы клеток в процентах от общего числа клеток измеряется.
В LYMрН-узлы, экспрессия IL-23 мРНК скоротечно увеличена во время доклинической фазе, тогда как экспрессия IL-6 мРНК увеличивается в болезнетворного зависимым образом. В селезенке, экспрессия мРНК IL-6 и IL-23 транзиторно возрастает в доклинической фазе, в то время как в начале болезни, экспрессия IL-1β мРНК повышается. В крови, экспрессия мРНК ФНО повышается в болезни-зависимым образом. В поясничном отделе спинного мозга, TNF - alpha, IL-1β и IFN & gamma ; увеличение во время острой фазы, в то время как IL-6 усиливает свою активность во время начала фазы (рисунок 5).
Рисунок 1: Схема рабочего потока для индукции и иммунологические оценки EAE. 1) ЕАЕ индуцируют у мышей приводит к развитию клинических симптомов. Клинические симптомы classifiред клиническими баллами, а не следующим образом: 0) каких-либо признаков, 0.5) дистальный паралич хвоста, 1) полный паралич хвоста, 1,5) хромать хвост и мягкий слабость задних ног, 2) хромать хвост и сильная слабость задних ног , 2,5) обмякшую хвост и паралич одной задней ноги, 3) безвольной хвост и паралич обеих задних конечностей. Число мышей , используемых на рисунке , показанном было 7. Фигура была изменена с Barthelmes и др. 28. 2) Мышей умерщвляли в различные моменты времени в течение болезни, селезенку, паховые лимфатические узлы, кровь и поясничного отдела спинного мозга извлечена и отдельные клетки , выделенные из этих тканей. 3) Иммунная распределение клеток в различных тканях, как было определено с помощью проточной цитометрии. 4) экспрессии мРНК для различных цитокинов в различных тканях, как это определено с помощью количественной ПЦР. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этого Figure.
Рис . 2: иммунные клетки Распределение, Определяются FACS (флуоресценция-Активированный сортировки клеток) Анализ в селезенке, лимфатических узлов, крови и спинного мозга образцы от ЕАЕ мышей на разных стадиях заболевания В эксперименте показано количество мышей в каждой группе было 2 - 10. распределение нейтрофилов / моноцитов в крови и нейтрофилы / макрофаги в спинном мозге адаптированы и модифицированы с Barthelmes и др. 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: CD4 + Т - клеток и CD8
Рисунок 4: стробирование стратегия для проточной цитометрии анализа Т - клеток, В - клетки, нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки и макрофаги спинного мозга EAE у мышей на 12 день А) показан график SSC / CD45 от всех клеток. Ворота:. CD45 + клетки Б) Участок FSC-H / FSC-W от CD45 + клетокs. Ворота: отдельные клетки C) Участок SSC-A / FSC-A из отдельных клеток.. Ворота: жизнеспособные клетки. D) Участок FSC-H / CD3 из жизнеспособных клеток. Ворота: CD3 + и CD3 - клетки Е) Участок CD4 / CD8 из CD3 + клеток.. Ворота: CD4 + CD8 - (CD4 + Т - клетки) и CD4 - CD8 + (CD8 + Т - клетки) F) Участок CD19 и Ly6G / CD11b из CD3 - клеток.. Ворота: CD19 + CD11b - клетки (В - клетки), Ly6G + CD11b + клетки (нейтрофилы) и CD19 - Ly6G - клетки G) показан график CD11c / клеток CD11b из CD19 - Ly6G - клетки:. Ворота CD11c + клетки (дендритные клетки ) и CD11c - клетки Н) показан график SSC / F4 / 80 фр.ом CD11c - клетки. Ворота: F4 / 80 - клетки (моноциты) и F4 / 80 + клеток (макрофаги). Один из представителей участок 9 показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5:. Цитокин профиля (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-23, TNF - alpha, IFN & gamma ; ) в образцах от EAE у мышей на разных стадиях заболевания А) лимфатических узлов, В) селезенка, С) в крови и D) , спинного мозга. уровни экспрессии мРНК нормализовали к пептидил пропиловый изомеразный A (PPIA) и рассчитывали с использованием уровня мРНК необработанных мышей того же возраста. Измерения проводились в трех экземплярах. Количество мышей в группе 2 - представлены 3. Результаты в виде среднего ± ГНАndard ошибки (SEM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Ген | вперед | задний ход | fragement размер (Вр) | ||||
IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
ИЛ-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
IFN & gamma; | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
TNF-alpha | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 |
Таблица 1: пар праймеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель EAE , описанный здесь получил наибольшее внимание как модель MS и обычно используется при тестировании терапевтических стратегий для MS 32. Заболевание мыши обладает многими клинические и гистологические характеристики МС и обусловлена индукцией аутоиммунитета к нейрональных антигенов. Сенсибилизация к миелиновых антигенов связано с гематоэнцефалического барьера дисфункции и, таким образом, инфильтрация клеток иммунной в ЦНС. Наши результаты показывают, что иммунные клетки увеличивают скоротечно в лимфатических узлах в острой фазе. Селезеночной Т-клетки и В-клетки уменьшаются в доклинической фазе заболевания. В циркулирующей крови, Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и моноциты увеличивают скоротечно в доклинической фазе, в то время как нейтрофилы увеличить болезнь зависимым от. И, наконец, в спинном мозге, повышение иммунных клеток выявляется (рисунок 2). Эти данные указывают на то, что Т-клетки и В-клетки мигрируют из селезенки, которая действуетрезервуар для этих клеток, в лимфатические узлы, где они активируются и пролиферируют. В дальнейшем они мигрируют через обращение в спинной мозг. Нейтрофилы, моноциты и дендритные клетки, с другой стороны, мигрируют из костного мозга путем циркуляции в ЦНС.
Наши данные показывают, что в спинном мозге, IFN & gamma;, ФНО и ИЛ-1β регулируются в болезнетворного зависимым образом, в то время как IL-6, промежуточно повышающей регуляции в начале заболевания. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что EAE патология приводится в движение Th1 и Th17 клеток. Th1 клетки продуцируют IFN & gamma ; , который в свою очередь активирует макрофаги выпустить TNF & alpha ; и IL-1β 33. Кроме того, ИЛ-6 , как известно, привод дифференциацию Th1 и Th17 клеток , и тем самым способствовать развитию EAE 34.
День начала клинических симптомов и тяжести заболевания варьирует у мышей EAE. Основываясь на нашем опыте, есть несколько гeasons для этого. Мышей, подвергнутых стрессу во время доклинической фазы показывают пониженную тяжесть заболевания и задержку начала заболевания. Корпус мышей также влияет на тяжесть аллергического энцефаломиелита, а также день начала болезни. В последнее время было показано , что синантропных микробиоты мышей влияют на развитие ЭАЭ 35 и различных жилищных ситуациях могут влиять на микробиомом и , таким образом, патология EAE. Кроме того, очень важно всегда использовать свежеприготовленные коклюшного токсина. Коклюшный токсин повреждает гематоэнцефалический барьер, который является предпосылкой для развития EAE. Не используйте эмульгированной MOG 35-55 пептида после истечения срока годности. Возраст мышей также влияет на EAE патологии. Таким образом, есть некоторые правила, которые должны быть выполнены для того, чтобы генерировать воспроизводимую модель EAE. Используйте мышей в возрасте от 10 до 13 недель и мышей от того же поставщика, если это возможно. Если мыши упорядочиваются у внешнего поставщика, позволяют мышам акклиматизироваться в течение двухнедель в доме животных. Ручка мышей нежно перед EAE индукции так, чтобы они привыкли к обращению. Избегайте ненужной обработки после EAE индукции. Обеспечить мышей с пищей и водой, которые они могут легко достичь, как только они показывают клинические симптомы. Если мыши должны быть обработаны с лекарственным средством, то лучше смешивать его в пищу или питьевую воду, чтобы избежать путая эффектов стресса. Если через желудочный зонд или инъекции имеет важное значение для введения лекарственных средств, важно, чтобы использовать один и тот же маршрут для транспортного средства.
В дополнение к основной модели прогрессивной EAE, описанной здесь, ремиттирующим модели EAE также существуют. Различная Конечно заболевание индуцируют введением различных антигенов в различных штаммов мышей. Таким образом, применение MOG 35 - 55 штаммов мышей, таких как C57BL / 6, Sv129, B10, NOD и мышей Biozzi, приводит к первичной форме прогрессирующее заболевание. Интересно, что в день начала отличается в различных линиях мышей. В то время какC57BL / 6, SV129 и мышей B10 развиваются первые клинические симптомы примерно от 11 -й день до 12, мышей Biozzi показывают первые клинические симптомы после 21 дня 36. В предыдущем исследовании было показано , что 129S4 / SvJae × C57BL / 6 гибридов первого демонстрируют клинические симптомы примерно от 11 -й день 28. Инъекция протеолипидного белка (PLP) 131-151 приводит у мышей SJL к индукции ремиттирующим Конечно , болезнь 37. Лучшая модель EAE использовать, будет зависеть от направленности исследования. Таким образом, если рецидивы фаза представляет интерес, то рецидивы-ремитент модель следует использовать в то время как, если начало заболевания является основным направлением, прогрессивная модель должна быть использована. Если роль специфического белка должен быть исследован в модели EAE, используя выбиваемые мышей, важно иметь в виду, что не все штаммы могут быть использованы для индукции EAE и, возможно, беккросс штамма цепную выходящими на чувствительный штамм необходимо.
Три наиболее широко используется тypes животных моделей МС: (1) Аутоантиген индуцированный EAE; (2) вирусно индуцированных спонтанное, хронические заболевания демиелинизации, и (3) токсин-индуцированной демиелинизации 38. Модели EAE характеризуются индукции воспаления и аутоиммунных реакций путем применения к аутоантигенных пептида , такие как миелин олигодендроцитов белка или протеолипидного белка 38. Спонтанное ЕАЕ развивается у трансгенных мышей , которые избыточно экспрессируют рецептор Т - клеток против пептида миелиновой олигодендроцитов белка 39. Для того, чтобы побудить вирусно-индуцированный хроническое воспаление, нейротрофический инфекцию центральной нервной системы могут быть вызваны, например, с Theiler`s мышиный вирус энцефаломиелита. Клетки , инфицированные вирусом подвергаются нападению как Т - клеток и гуморального ответа и тем самым привести к хронической демиелинизации 40,41. Токсин-индуцированные демиелинизация может быть вызван, например , с медью хелатор cuprizone 42. Эта модель приводит конкретно к demyeliнации, потому что cuprizone нападает на олигодендроциты и ведет, таким образом, к активации астроглию и микроглии, а воспалительные процессы играют лишь незначительную роль. После клиренса токсина, новые олигодендроциты генерируются и новый миелиновой оболочки образуется. Использование этих трех моделей, взаимодополняющим образом, позволяет оценить эффекты наркотиков по различным аспектам патогенеза МС, так как модели различаются в отношении воспалительных и иммунных и демиелинизирующих процессов. В EAE и вирус-индуцированной модели, воспаления и аутоиммунных процессах, прежде всего, привод заболевание, в то время как в токсин-индуцированной модели, демиелинизирующих и remyelinating процессы являются преобладающими. Для доклинических испытаний потенциальных лекарственных препаратов для лечения рассеянного склероза, по крайней мере, три модели, токсин-индуцированной модели, обострений и ремиссий EAE и первичной прогрессивной EAE или вирусно-индуцированной модели следует использовать для проверки эффективности препарата.
Модель EAE описал еее может быть использован для получения более глубокое представление о механизме развития процесса MS-подобного заболевания, выявление ключевых клеточных драйверов заболевания, такие как Th1, Th17 и В - клеток 43,44. Чем лучше понимание воспалительных и иммунных процессов, участвующих в развитии МС и процессов, которые способствуют и устранить повреждения, тем больше вероятность того, что новые стратегии лечения могут быть разработаны.
Тем не менее, модель EAE, описанный здесь просто имеет некоторые общие черты с рассеянным склерозом, а также имеет несколько четких отличий от болезни человека. Наиболее заметным отличием является то, пациенты с РС широко варьируются в презентации болезни, которая не воспроизводится в модели EAE. Это может быть связано с различными формами поражения у больных рассеянным склерозом и мышей EAE и к тому, что мыши являются инбредные штаммы. У мышей, EAE, однородные поражения наиболее заметны в спинном мозге, тогда как у пациентов с рассеянным склерозом, в первую очередь гетерогенные пораженияв мозге 45,46. Кроме того, мобильная станция и EAE разделяют важный вклад Th1 клеток и клеток Th17 для их развития, но в отличие от MS, CD8 + Т - клетки играют незначительную роль в EAE патологии 33. В заключение отметим, что модель EAE сосредоточена главным образом на комбинированных эффектов аутоиммунитете, воспалительных процессов и нейродегенеративные тогда демиелинизирующие процессы менее поддаются выборочной оценкой. Таким образом, другие животные модели , такие как модель cuprizone могут быть использованы для Отчетливый исследование демиелинизирующих процессов 47. Модель EAE несовершенен, но , тем не менее, полезная модель MS 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
References
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
- Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
- Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
- Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
- Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
- Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
- Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
- Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
- Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
- Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
- Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
- Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
- Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
- Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
- Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
- Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
- Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
- Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
- Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
- Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
- Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
- Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
- Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
- Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
- 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
- Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
- Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015). - Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
- Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
- El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
- Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
- Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).