Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Un procédé d'injection de silicone modifié a été utilisé pour la visualisation de l'arbre vasculaire hépatique. Cette procédure est composée d' une injection in vivo du composé de silicone, par l' intermédiaire d' un cathéter 26 G, dans le portail ou la veine hépatique. Après l' injection de silicone, les organes ont été explantées et préparés pour les micro-CT (μCT) à balayage ex vivo. La procédure d'injection de silicone est techniquement difficile. La réalisation d'un résultat positif nécessite une vaste expérience de microchirurgie du chirurgien. L'un des défis de cette procédure consiste à déterminer le taux de perfusion adéquate pour le composé de silicone. Le taux de perfusion du composé de type silicone doit être définie sur la base de l'hémodynamique du système vasculaire d'intérêt. débit de perfusion inappropriée peut conduire à une perfusion incomplète, la dilatation artificielle et rupture des arbres vasculaires.
La reconstruction en 3D du système vasculaire a été basée sur des tomodensitogrammes et a été réalisée en utilisantun logiciel pré-clinique tel que HepaVision. La qualité de l'arbre vasculaire reconstruit était directement liée à la qualité de silicone perfusion. paramètres vasculaires suite calculés indiquant la croissance vasculaire, tels que le volume vasculaire total ont été calculées sur la base des reconstructions vasculaires. Contrastant l'arbre vasculaire avec du silicone permis ultérieure histologique travail-up de l'échantillon après la numérisation μCT. L'échantillon peut être soumis à des coupes sériées, l'analyse histologique et de numérisation de diapositives ensemble, et par la suite à la reconstruction en 3D des arbres vasculaires à partir d'images histologiques. Ceci est la condition sine qua non pour la détection d'événements moléculaires et de leur distribution par rapport à l'arbre vasculaire. Ce procédé d'injection de silicone modifiée peut également être utilisée pour visualiser et reconstruire les systèmes vasculaires des autres organes. Cette technique a le potentiel d'être largement appliquée à des études concernant l'anatomie vasculaire et la croissance dans différents animaux undes modèles de maladies nd.
Introduction
La régénération du foie est souvent déterminée en mesurant l'augmentation du poids du foie et de volume et en évaluant le taux de prolifération des hépatocytes 16. Cependant, la régénération du foie est non seulement induit la régénération parenchymateuse mais aussi la régénération vasculaire 6. Par conséquent, la croissance vasculaire doit être étudiée plus avant en ce qui concerne son rôle dans la progression de la régénération du foie. Visualisation du système vasculaire hépatique est essentielle pour faire progresser notre compréhension de la régénération vasculaire. De nombreuses méthodes indirectes ont été développées pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la régénération vasculaire hépatique. Traditionnellement, la détection des cytokines (facteur de croissance vasculaire endothéliale, VEGF) 14, les chimiokines et leurs récepteurs (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 ont été le pilier pour étudier la régénération vasculaire. Cependant, un modèle 3D conjointement avec l'analyse quantitative de la vasculature ajouterait anatomique critiqueinformations pour acquérir une meilleure compréhension de la relation importante entre parenchyme hépatique et la régénération vasculaire.
Pour visualiser le système vasculaire du foie, ce qui nécessite contrastante les arbres vasculaires, les souris ont reçu une injection d'un agent de contraste radio-opaque caoutchouc de silicone directement dans le portail ou un arbre vasculaire veineux hépatique. Après polymérisation de la silicone et de l'explantation de l'organe, les échantillons de foie ont été soumis à un balayage μCT en utilisant un scanner CT. Les analyses ont donné lieu à voxel images représentations de la silicone d'injection 9 spécimens.
Pour le contrôle qualité, le système vasculaire a été visualisé en premier en 3D en utilisant le logiciel pré-clinique. La segmentation a été effectuée en fixant un seuil entre l'intensité des tissus mous et l'intensité de la cuve. Le masque de cuve résultant a été visualisé en utilisant le rendu de surface. Le logiciel a également permis la détermination manuelle de deux paramètres de vasculcroissance ar: longueur maximale du navire et le rayon.
Un logiciel préclinique a été ensuite utilisé pour la reconstruction 3D des arbres vasculaires et le calcul ultérieur des territoires vasculaires alimentant ou drainant 13. De plus, ce logiciel détermine automatiquement certains paramètres de la croissance vasculaire, tels que la longueur totale de toutes les structures vasculaires visibles également connu sous le nom de longueur d'arête ou le volume total de la cuve totale.
La procédure de silicone de perfusion a été réalisée chez des souris naïves et chez les souris ayant subi une hépatectomie partielle de 70% (PH). Les foies ont été prélevés à différents temps d'observation après résection pour l'analyse vasculaire et parenchymateuse régénération du foie en utilisant la technique de visualisation et de quantification précitée.
Les objectifs principaux de ce film sont les suivants: (1) démontrer l'injection technique délicate nécessaire pour atteindre contraste optimal et (2) montrent le potentiel fr profit qui en résulteom une analyse détaillée de l'échantillon résultant en utilisant μCT et coupes en série histologiques. Après avoir vu ce film, le lecteur devrait avoir une meilleure compréhension de la façon d'injecter composé de silicone dans un système vasculaire spécifique et de l'utilité et l'applicabilité de la technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrastante l'arbre vasculaire par injection de silicone et de balayage μCT a été introduit dans des modèles de tumeurs et des modèles de maladies neurologiques fréquemment pour étudier la progression angiogénique 5,7,8,10. Améliorations à la méthode de l'injection de silicone ont été faites dans la présente étude pour la visualisation et la quantification de la croissance vasculaire après hépatectomie partielle chez la souris.
Il y a un certain nombre d&…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
Referências
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