The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Всего монтаж гибридизация (WMISH) представляет собой метод , который позволяет для пространственного разрешения молекул нуклеиновых кислот (часто) в мРНК препарата ткани , '' всей монтировки или стадии развития (такие , как эмбрион или личинку) , представляющие интерес. WMISH является чрезвычайно мощным, поскольку он может внести значительный вклад в функциональной характеристике сложных многоклеточных геномов, вызов, который становится все более узким местом с наводнением последовательности данных следующего поколения. Несмотря на концептуальную простоту методики много времени часто требуется, чтобы оптимизировать различные параметры, присущие WMISH экспериментов для новых модельных систем; тонкие различия в клеточном и биохимических свойствах между типами тканей и стадий развития означает, что один метод WMISH может не подходить для всех ситуаций. Мы разработали множество методов WMISH для вновь возникающие брюхоногих модели Большой Прудовик , которые генерируют последовательный ичеткие сигналы WMISH для ряда генов, и на всех стадиях развития. Эти методы включают в себя назначение личинок неизвестного хронологического возраста к онтогенетического окна, эффективное удаление эмбрионов и личинок из их кубышки, применение соответствующего лечения Протеиназный-K для каждого онтогенетического окна и гибридизацию, пост-гибридизацию и иммунологического шаги. Эти методы обеспечивают основу, из которой результирующий сигнал для данного РНК-транскрипта может быть дополнительно уточнена при помощи зонда конкретных корректировок (в первую очередь исследовать концентрацию и температуру гибридизации).
Моллюски являются группой животных, которые удерживают интерес широкого разнообразия научных дисциплин. Несмотря на их морфологическое разнообразие 1, богатство видов (уступает только членистоногих с точки зрения видового числа 2) и отношение к широкому кругу коммерческих 3, 4 медицинских и научных вопросов 5-8, существует относительно небольшое число видов , которые моллюсков могут претендовать быть как хорошо оснащенные научные модели и легко поддерживать в лабораторных условиях. Один моллюск , который используется много дисциплин , таких как нейробиологии 9, экотоксикологии 10 и более недавно эволюционной биологии 11,12, является Большой Прудовик, в первую очередь из – за его широкого распространения и легкость в обслуживании. Несмотря на свою популярность как «модель» организма и его долгую историю использования онтогенетики 13-19, диапазон и мощности молекулярных инструментов , доступных для L. stagnAlis научное сообщество находится далеко отстает от более традиционных моделей животных (Drosophila, мышь, морского ежа, нематоды).
Наше желание развивать Lymnaea как молекулярная модель связана с интересом в молекулярных механизмах , которые направляют формирование оболочки. Это побудило нас уточнить набор методов , которые позволили бы эффективной, последовательной и чувствительной визуализации экспрессии генов в процессе развития Lymnaea 's. Всего монтаж гибридизация (WMISH) широко используется для различных модельных организмов и используется уже в течение более чем 40 лет 20. В своих различных формах, ISH могут быть использованы для пространственно локализовать специфические локусы на хромосомах, рРНК, мРНК и микро-РНК.
Одна из проблем , нам необходимо обратиться до уточнения метода WMISH для L. stagnalis был вопрос мягко и эффективно добывающим эмбрионов и личинок разных стадиях от тон кубышки, в которых они оседают. Это извлечение, или "декапсуляция ', должно быть достигнуто эффективно для того , чтобы собрать материал , достаточного для данного эксперимента на месте, в то же время сохраняя при этом морфологические и клеточную целостность. В то время как другие модели организмы также подвергаются инкапсулированы развитию, в наших руках ни один из методов , представленных за этих видов не может быть успешно применен в L. stagnalis.
Общие цели этого метода являются поэтому: чтобы извлечь L. stagnalis эмбрионов и личинок из их капсул в высокой пропускной способности моды, применять предварительно гибридизационных процедуры , которые оптимизируют сигнал WMISH, для подготовки эмбрионов и личинок с удовлетворительными WMISHsignals для работы с изображениями.
Описанный здесь метод позволяет эффективно визуализации РНК – транскриптов с предположительно различными уровнями экспрессии в пределах всех стадиях развития Большой Прудовик. Для удаления эмбрионов и личинок из их капсул мы опробовали различные химические, осмотического шока …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование для проекта DJJ через DFG # JA2108 / 2-1.
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |