Abstract
Även om det är accepterat att hjärtat har en begränsad potential att regenerera hjärtmuskelceller efter skada och att låga nivåer av cardiomyocyte omsättning inträffar under normalt åldrande, kvantifiering av dessa händelser förblir utmanande. Detta beror delvis på att sällsynthet i processen och det faktum att flera cellulära källor bidrar till hjärtinfarkt underhåll. Dessutom leder ofta DNA dubbel inom cardiomyocytes till en polyploid cardiomyocyte och endast sällan leder till nya hjärtmuskelceller genom celldelning. I syfte att exakt kvantifiera cardiomyocyte diskriminering omsättning mellan dessa processer är av avgörande betydelse. Protokollet som beskrivs här använder långsiktig nukleosid märkning för att märka alla kärnor som har uppstått som ett resultat av DNA-replikation och cardiomyocyte kärnor som identifierats genom att använda kärnor isolering och efterföljande PCM1 immunomärkning. Tillsammans detta tillåter noggrann och känslig identifiering av nukleosid märkning av cardiomyocyte kärnor populationen. Vidare, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol märkning och analys av kärnorna ploiditet, möjliggör diskriminering av neo-cardiomyocyte kärnor från kärnor som har införlivat nukleosid under polyploidization. Även om denna metod inte kan kontrollera för cardiomyocyte binucleation, gör det en snabb och robust kvantifiering av neo-cardiomyocyte kärnor samtidigt står för polyploidization. Denna metod har ett antal tillämpningar nedströms inklusive bedöma potentiella läkemedel för att förbättra cardiomyocyte regenerering eller att undersöka effekterna av hjärtsjukdom på cardiomyocyte omsättning och ploiditet. Denna teknik är också kompatibel med ytterligare nedströms immunohistologiska tekniker, vilket möjliggör kvantifiering av nukleosid inkorporering i alla hjärtcelltyper.
Introduction
Under de senaste åren har det skett en ansamling av bevis utmanar antagandet att hjärtat är en terminalt differentierad, post-mitotiska organ 1,2. Men kvantifiering av cardiomyocyte omsättning och förnyelse är fortsatt utmanande.
Svårigheterna att exakt identifiera sällsynta cardiomyocyte generation användning av standard immunhistokemiska tekniker är väl rapporteras tre. Dessutom cellulära källan till cardiomyocyte generationen är fortfarande osäker med bevis för bidrag cardiomyocyte spridning samt av stamcellsdifferentiering 4-6. Därför är det omöjligt och kvantifiering av proliferation i en enda population, inklusive hjärtmuskelceller användning av härstamning spåra modeller som kräver kunskap om cardiomyocyte progenitorceller fenotypen är olämpligt. Dessutom en cardiomyocyte har potential för endoreplication utan karyokinesis (vilket resulterar i en polyploid bildiomyocyte) eller karyokinesis i frånvaro av cytokines (resulterande i en binucleated cardiomyocyte) 7,8. Den exakta kvantifieringen av cardiomyocyte omsättningen beror på förmågan att skilja mellan dessa händelser och sann neo-cardiomyocyte generation. Detta skapar unika komplikationer eftersom DNA-replikation och expression av cyklinberoende kinaser i kardiomyocyter inte uteslutande demonstrerar sanna celldelning 9,10.
För att underlätta kvantifieringen av neo-cardiomyocyte generation, har vi kombinerat en etablerad kärnor isoleringsteknik, och immunologisk märkning av pericentriolar material 1 (PCM1) för cardiomyocyte kärnor identifiering som beskrivs av Bergmann et al. 7,11 med nya metoder för lång sikt DNA märkning och ploidi analys. PCM-1 är en centrosom protein som ackumuleras i kärnytan av differentierade, icke-cykling myocyter. Tidigare studier har visat att antikroppar motPCM-1 specifikt märka cardiomyocyte kärnor 7,11 och som sådan PCM1 har använts av ett antal oberoende grupper för att identifiera cardiomyocytes 1,12,13. Dessutom har vi visat att PCM1 uttryck avbildas till genetiskt märkta cardiomyocyte kärnor i TnT-cre transgen musmodell 14 (Kompletterande Figur 1).
Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att exakt och känslig identifiering av neo cardiomyocyte kärnor generering i mus hjärtat, oberoende av de cellulära ursprunget (Figur 1A och B) och samtidigt exklusive nukleosid märkning på grund av polyploidization från analysen (Figur 1C och D). Även om denna metod inte kan kontrollera för cardiomyocyte binucleation, gör det en snabb och robust kvantifiering av neo-cardiomyocyte kärnor som krävs för noggrann kvantifiering av cardiomyocyte omsättning. Dessutom,det ger en snabb screeningmetod för att bedöma eventuella förändringar i dynamiken i cardiomyocyte generation.
Medan DNA-märkning innebär vanligtvis 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) som tymidinanalog, det protokoll som beskrivs här använder en 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EDU) baserad analys eftersom det kräver färre bearbetningssteg för en snabbare genomströmning och kräver inte denaturering av DNA för immundetektering, vilket gör den kompatibel med andra immunfärgning protokoll och därigenom öka de potentiella tillämpningar av metoden nedströms.
Figur 1: Kontinuerlig pulserande med EDU etiketter neo-kardiomyocyter oavsett deras föregångare. (A) EDU inkorporeras i DNA hos kardiomyocyter under celldelning. Spridning i cardiomyocyte befolkningen Result i en ökning av, eller utbyte av kardiomyocyter och är därför produktiv DNA-syntes (bidrar till vävnads underhåll och reparation). (B) EDU inkorporeras i DNA hos hjärt progenitorceller under celldelning. Detta kommer att kvarhållas i cellen under differentiering till cardiomyocyte härstamning. Denna stamcellsdifferentiering kommer också att resultera i en ökning av antalet kardiomyocyter och bidrar därför till vävnad underhåll och reparation. (C) Cardiomyocytes har potential att genomgå "icke-produktiv" DNA-replikation resulterar i ökad cardiomyocyte ploiditet, som är associerad med cardiomyocyte hypertrofi och myokardiell ombyggnad, men ersätter inte förlorade kardiomyocyter. Processen för polyploidization skiljer sig från binucleation eftersom det resulterar i en cardiomyocyte med en enda kärnor som innehåller fyra eller flera uppsättningar av två homologa kromosomer (> 2N). (D) Efter en kontinuerlig kärnor pulse, beskriver detta protokoll kärnor isolering och identifiering av cardiomyocyte kärnor av PCM1 uttryck för att möjliggöra kvantifiering av både cardiomyocyte ploidi och edu inkorporering. PCM1 uttryck och EDU inkorporering detekteras med hjälp av flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Djur arbete beviljats och godkänts av Newcastle University etikprövningsnämnd. Alla djurförsök utfördes som överensstämmer med de riktlinjer från direktiv 2010/63 / EG Europaparlamentets om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. edu Administration
- Upplösa edu i steril koksaltlösning (0,9% vikt / volym) vid en slutkoncentration av 12,5 mg / ml.
- Värm lösningen till 40 ° C och skaka för att fullständigt upplösas. Lagra tillräckligt edu / saltlösning vid 4 ° C för att injicera alla möss i studien vilket möjliggör 6 dagliga injektioner.
Notera: Typiskt över sex möss krävs för varje experimentgrupp. Dock bör effektberäkningar utföras för självstudier.
- Värm lösningen till 40 ° C och skaka för att fullständigt upplösas. Lagra tillräckligt edu / saltlösning vid 4 ° C för att injicera alla möss i studien vilket möjliggör 6 dagliga injektioner.
- Väg individuella möss. Beräkna den erforderliga volymen för att administrera 100 ug / g av edu / saltlösning till varje mus (8 | il lager EDU lösning per g).
- Rita lämplig volume av edu / saltlösning i insulinspruta med en 25 G-nål.
- Utför intraperitoneal (ip) injektioner vid hantering möss med godkända hemmakontoret tekniker.
- Placera en mus på buren locket. Dra försiktigt tillbaka på basen av svansen och stadigt tag i musen i nackskinnet.
- Exponera buken för injektion genom att hålla musen med pekfingret och tummen nära basen av huvudet och tippning av djurets huvud bakåt mot golvet.
- Torka av buken med 70% alkohollösning. Leta reda på djurets mittlinjen och nedre högra kvadranten. Injicera edu / saltlösning i djuret i den nedre högra kvadranten.
- Injicera möss med edu / saltlösning och registrera tiden på dygnet.
- Upprepa steg 1,2 till 1,4 vid samma tid på dagen, under 6 på varandra följande dagar.
Obs: Som en edu negativ kontroll krävs för att ställa in grind för flödescytometrisk analys, injicerar en ytterligare ålder, kön och experimentellt matchaed mus med en ekvivalent volym saltlösning utan edu. Detta kommer att ge den erforderliga kontrollen (ingen EDU kontroll). Denna kontroll bör inkluderas för varje undersökning för att möjliggöra variationer i reagenssatser och cytometern inrättas.
2. Skörd Hjärtan
- Vid 24 timmar efter den 6: e edu injektion, offra möss med användning av halsdislokation (eller ett alternativt schema 1 Home Office godkänd metod).
- Placera offras djuret i ryggläge och göra hudsnitt från mitten buken till membranet med kirurgisk sax.
- Skära membranet, och hålla bröstbenet bort från kroppshåligheten, skärs bilateralt för att exponera hjärtat.
- Lyft hjärtat något och skär de stora blodkärlen i utflödesområdet för att dissekera hjärtat ur brösthålan.
- Omedelbart placera varje hjärta i till en individuell 15 ml centrifugrör innehållande 10 ml PBS kylas till 4 ° C.
- Överför hjärtan till SEParate 10 cm petriskålar, med hjälp av en skalpell skär varje hjärta i två i en sagittal orientering och tvätta hjärtat genom att försiktigt klämma med en pincett. Sedan ersätta PBS för att avlägsna så mycket blod som möjligt. Upprepa detta steg två gånger.
- Placera båda delarna av varje hjärta i samma individ 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Fortsätt till steg 3 eller alternativt lagra prover -80 ° C som beskrivs i steg 2,9 och 2,10.
- Med användning av en 25 G-nål, gör ett litet hål i locket mikrocentrifugrör för att förhindra locket från att öppnas på grund av expansionen av gaserna när hjärtat bearbetas.
- Märk varje mikrocentrifugrör och placera i en behållare med flytande kväve för att frysa.
3. Kärnor Dissociation och cardiomyocyte Nuclei Märkning
Obs! Denna kärnor dissociation och cardiomyocyte kärnor märkning anpassat sig från Bergmann et al 11 Utför den här proceduren på alla prover injiceras.med edu och saltlösning injiceras (Inga EDU kontroll) negativ kontroll. Se tabell 1 för receptet lösningar som krävs för att utföra de här stegen.
- För varje hjärta som skall analyseras, placera 36 ml av 1% BSA / PBS-lösning in i ett ultracentrifugrör, inkubera under 30 min, kasta lösningen och låt sedan lufttorka.
Obs! Detta rör används i steg 3,6. - Placera enskilda frysta hjärtan på en 10 mm skål på is och färs med hjälp av en skalpell låta hjärtan att tina under malningen processen.
- Placera malet hjärtan in i 15 ml Cell Lysis buffert i ett 50 ml centrifugrör och homogenisera med en sond homogenisator under 15 sekunder vid 25000 rpm vid rumstemperatur.
- Tillsätt ytterligare 15 ml Cell Lysis Buffer till centrifugröret och överför till en 40 ml Dounce med en stor clearance mortelstöt. Utför 10 slag med mortelstöt och filtrera genom en 100 pm sedan 40 ìm cell sil i ett 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera i 10 minuter tillsattes ent 700 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera den nukleära pelleten i 25 ml sackarosgradient Lösning och lager cellkärnorna som innehåller lösningen på toppen av 10 ml av färskt sackarosgradient lösning i ultracentrifugrör framställd i 3,1.
- Centrifugera vid 13.000 xg under 1 h vid 4 ° C med användning av en gunga ut röret rotorn.
- Efter centrifugeringen, kassera supernatanten och resuspendera kärnor pelleten i 1300 il kärnor lagringsbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och etikett PCM1.
- Avlägsna 300 pl av suspensionen i ett annat mikrocentrifugrör och tillsätt till 700 | il färskt kärnor lagringsbuffert. Märk detta rör som ISO-kontroll.
- Lägg anti-PCM1 vid en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till mikrocentrifugrör märkta PCM1 och lägga Kanin IgG isotyp kontrollantikropp vid en koncentration av 8 | ig / ml till mikrocentrifugrör märkta ISO kontroll.
- Inkubera över natten vid 4 ° C. följande incubation, centrifugera vid 700 xg under 10 minuter, kassera supernatanten, ersätt med 1 ml färsk kärnor lagringsbuffert, resuspendera och centrifugera igen i 10 minuter vid 700 x g. Kassera supernatanten och ersätta med 1 ml färsk kärnor lagringsbuffert.
- Tillsätt 1 pl av F (ab ') 2-fragment av get anti-kanin IgG (H + L) antikropp (FITC- eller ekvivalent grön-fluorescerande färgämne) för att uppnå en slutlig koncentration av 2 | ig / ml.
Anmärkning: Användning av en F (ab ') 2 antikroppsfragmentet minskar potentialen för icke-specifik märkning av immunceller inkluderande makrofager och B-celler. - Wrap rör i aluminiumfolie för att skydda från ljus och inkubera under 1 h vid 4 ° C.
4. Upptäckt av EDu Incorporation
- Utspädd 10x koncentrerad edu reaktionsbuffert 1:10 med avjoniserat vatten.
- Centrifugera PCM-1 och ISO kontroll märkta kärnor suspensioner vid 700 xg under 10 minuter, kasta supernatanten och resuspendera kärnor pelleten i 1 ml1% BSA / PBS-lösning. Tvätta kärnor pelleten två gånger.
- Efter den slutliga tvätten, kassera supernatanten och ersätt med 100 pl av EDU fixativ.
- Linda rör i aluminiumfolie för att skydda från ljus och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
- Tvätta proverna två gånger med 1 ml 1% BSA / PBS-lösning, centrifugera vid 700 xg och inkubera med 1x saponin-baserade permeabilization lösning vid rumstemperatur under 15 min.
- Förbereda 1x edu märkningscocktail (tabell 2). Minst 2 reaktioner kommer att krävas för att inkludera Inga EDU kontroll.
- Tillsätt 500 pl av 1x edu märkningscocktail direkt till varje prov som redan innehåller kärnor i 100 pl 1x saponin-baserade permeabilization lösning och inkubera vid rumstemperatur skyddad från ljus under 30 min.
- Centrifugera vid 700 xg och återsuspendera i 1 ml 1% BSA / PBS och upprepa detta steg två gånger.
- Centrifugera vid 700 xg, kassera supernatanten och ersätta med 400 pl DNA-färgningslösning (se tabell of Materials).
| Reagensets namn |
| 1. Cell Lysis Buffer |
| 0,32 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 2,0 mM EDTA |
| 0,5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2.Sucrose Gradient Lösning |
| 2,1 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 1 mM DTT |
| 3. Nuclei lagringsbuffert (NSB) |
| 0,44 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1,5 mM spermin |
Tabell 1: Nuclei isolering buffertingredienser Recept för alla buffertar som används i protokollenheten 3 (Nuclei dissociation och cardiomyocyte kärnor märkning)..
5. flödescytometrisk analys
Obs: Utför Flödescytometri på isolerade kärnor som beskrivits tidigare 7,11,15.
- Först skapar en tomt som beskriver Forward Scatter (FSC) och sidospridning (SSC) för att tillåta diskriminering av kärnor från skräp (Figur 2A).
- Skapa en komplott för att diskriminera enskilda kärnor från aggregat (Figur 2B) genom att rita 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) (DAPI) område (3-405 / 450/50 A) i förhållande till höjd (33-405 / 450 / 50-H). säkerställa that den 3-405 / 450/50 En signal uppsamlas på den linjära skalan för att tillåta korrekt bestämning av DNA-innehållet.
- Skapa ett diagram som beskriver 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC och endast visa händelser från sing porten skapades 5,2 för att bedöma PCM-1 uttryck i sing befolkningen.
- Häll provet isotypkontroll för att etablera en PCM-1 positiv grind (figur 2C). Köra en liten mängd PCM1 märkt prov för att verifiera PCM1 uttryckande populationen och grindningsposition.
- Skapa ett diagram som beskriver SSC-A vs 405/450/50-A (för att upptäcka DAPI). I denna kurva, endast display sing PCM1 uttrycker kärnor med hjälp av portar som skapats i 5,3. Använd denna kurva för att skapa ytterligare en hierarkisk grind som innehåller endast 2N kärnor (figur 2D).
- Skapa ett diagram som beskriver 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A för att möjliggöra identifiering av edu märkning av PCM1 uttrycker cardiomyocyte befolkning. Bara visa kärnor som sing, P CM1 + och 2N användning av ovanstående gating.
- Kör hjärta prov från någon edu för att ställa in edu positiva porten (Figur 2E). Skapa en lämplig grind för edu + celler.
- Spela in och kvantifiera sing, PCM-1 uttryckande, 2N kärnor som har införlivats edu.
- Beräkna denna population som andel av den totala sing, PCM1 + kärnor. Detta kommer att ge graden av neo-cardiomyocyte kärnor generation, under 7 dagar edu pulsperiod, i procent av den totala cardiomyocyte kärnor.
Notera: Eftersom DAPI-bindning till DNA är stökiometrisk fluorescensintensiteten är proportionell mot mängden av DNA. Bestämma ploidi baserat på intensiteten av 405/450/50 A-signal, såsom beskrivits tidigare 7. - För att utvärdera ploiditet inom den totala cardiomyocyte befolkningen använder tomten grundades 5,5 och en grind strategi baserad på DNA-koncentration 7.
/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/>
Figur 2:. Gating strategi för att kvantifiera cardiomyocyte edu inkorporering och ploiditet (A) Kärnor diskrimineras från skräp baserat på framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC). (B) En linjär grind skapas och sing kärnor befolkningen identifieras baserat på DAPI märkning och 405/450/50 höjd vs område signal. (C) Fluorescerande gating tillåter separation av cardiomyocyte kärnor (PCM-1-positiva) och icke-cardiomyocyte (PCM-1-negativa) kärnor från hjärtvävnaden. (D) Intensitet av DAPI-signalen används för att bestämma DNA-koncentration och därmed kärnor ploiditet av PCM1 + cardiomyocyte befolkningen. I mus> 80% av cardiomyocyte kärnor är diploid (2n). (E) Fluorescent gating tillåter separation av 2N, cardiomyocyte kärnor som har införlivat edu (PCM + / EDU + = 0,9%) från 2N, kardiomyocyter som inte har införlivats edu (PCM + utbild-). Alla steg beskrivs i protokollet 5.0. Exempel visas från MDX -. / Y möss på C57 / BL10 bakgrund Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Denna metod medger kvantifiering av ökat edu inkorporering grund av cardiomyocyte kärnor division under reglering för ökad polyploidization. Med hjälp av en BrdU baserad analys, tidigare visade vi att däggdjurens hjärta reagerar på kronisk cardiomyocyte förlust i MDX musmodell av Duchennes muskeldystrofi, med förnyelse av nya hjärtmuskelceller. Vi har använt de metoder som beskrivs här för att ytterligare validera våra publicerade resultat och för att demonstrera nyttan av protokollet. Enligt det protokoll som beskrivits; vuxna (12 veckor gamla) MDX och kontroll BL10 möss pulsades med en daglig injektion av edu i 7 dagar, rapporterade tidigare att tillåta statiskt analys mellan experimentella grupper 5,13. Immunhistologisk analys av pulsade hjärtan visar närvaron av PCM1 uttryckande kardiomyocyter som har införlivat edu (figur 3A). Emellertid de data som erhållits using immunohistologiska metoder kan misstolkas, som andra celltyper som har införlivat edu kan feltolkas som kardiomyocyter. Ett exempel på detta demonstreras i Kompletterande Figur 1A och B. Dessutom immunohistologiska metoder inte skiljer polyploidization från kärn division. Den flödescytometrianalys beskrivs i detta protokoll möjliggör snabb kvantifiering av cardiomyocyte kärn division i MDX och kontrollmöss, medan undantag celler som hade inkorporerat edu grund av polyploidization. I likhet med tidigare publicerade data 13, avslöjade analys en höjning av neo-cardiomyocyte kärnor generation i MDX mus hjärtan jämfört med åldersmatchade kontroller (1,2% jämfört med 0,17%, Figur 3B och C).
Figur 3: Kvantifiering av edu märkta kardiomyocyter i vildtyp och MDX hjärtan. (A) Bild av Z-stack prognoser tagna från 40 um tjocka sektioner av MDX hjärtan. PCM-1 uttrycker cardiomyocyte kärnor (grön) som har införlivat EDU (röd). Gul pil indikerar edu märkta cardiomyocytes. I och II indikerar individuella edu märkta kardiomyocyter som visas i Z-planet. Kärnor märkta med DAPI (blå) (B och C) Flödescytometri av isolerade kärnor som visar representativa kurvor 12-13 veckor gamla vild typ (C57 / BL10) och MDX-möss (MDX - / y på C57 / BL10 bakgrund). (B) Histogram visar DAPI intensitet och diskriminering mellan 2N och> 2N kärnor. (C) diagram som visar edu inkorporering i 2N cardiomyocyte kärnor befolkningen vid analys som beskrivs i detta protokoll. För alla möss Utb administrerades under en vecka från en2 veckors ålder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 1:. PCM-1 är en specifik markör för cardiomyocyte kärnor Under användning av protokollet beskrivet kärnorna isolerades från den dubbla transgena musen som produceras genom att korsa TNT-cre möss 14 med ROSA nT / nG cre känsliga reporter linje 16. I den resulterande mus cre aktivering under kontroll av Troponin T (TNT) promotorn leder till irreversibel uttryck av GFP med är lokaliserad till kärnorna. Kärnor märkta med isotypisk kontroll (ISO) visar förmågan att identifiera GFP som uttrycker cardiomyocyte kärnor befolkningen (488/530/30-A). Märkning av kärnor med anti-PCM1 (sekundär antikropp som detekteras av 633-660 / 20-A) visar korrelationen av PCM1 expression med GFP-uttryck cardiomyocyte kärnor populationen. I detta exempel 98,8% av cardiomyocyte kärnor som identifierats av TNT promotoraktivitet, märkta av PCM1 antikropp. Klicka här för att ladda Kompletterande Figur 1.
Kompletterande Figur 2:. Utmaningar för att kvantifiera förnyelse cardiomyocyte av immunohistologiska tekniker (A) 2D Bilden visar två PCM-1 uttrycker cardiomyocyte kärnor (grön) som verkar vara även märkt EDU (röd). Gula pilar indikerar vad som verkar vara hjärtmuskelceller som har införlivats edu. Detta beror på att den skenbara sam-lokalisering av PCM1 expression och EDU märkning när visualiseras med 2-dimentional avbildning. (B) En 3-dimensionell projektion av denna bild identifierar edu märkta celler är inte hjärtmuskelceller men är icke-cardiomyocyte celler överliggande PCM1 som uttrycker cardiomyocyte kärnor. C57 / BL10 möss vid 12 veckors ålder användes för experiment. Klicka här för att ladda Kompletterande figur 2A. Klicka god här för att hämta kompletterande figur 2B.
| reaktionskomponenter | Antal reaktioner | |
| 2 | 5 | |
| PBS | 875 | il | 2,19 ml |
| koppar Protectant | 20 ^ | 50 ^ |
| Fluorescerande färgämne pikolyl azid | 5 pl | 12,5 | il |
| reaktionen späddesbuffert som framställts i 4,1 | 100 ^ | 250 | il |
| Total reaktionsvolym | 1 ml | 2,5 ml |
Tabell 2: EDU cocktail ingredienser. Recept för edu märkning cocktail krävs i protokollet avsnitt 4 (Upptäckt av EDU inkorporering).
Discussion
För att exakt kvantifiera cardiomyocyte omsättning och regenereringsanalyser måste skilja mellan sant cardiomyocyte generation och icke-produktiv DNA division. Många studier fortsätter att helt enkelt ignorera dessa icke-produktiva händelser, kvantifiera cardiomyocyte spridning enbart via uttryck av cyklin Kinesis och cellcykel markörer. Hittills en enda metod som gör det möjligt att exakt kvantifiering av cardiomyocyte omsättning under reglering för dessa icke-produktiva händelser förblir anspelande. I synnerhet är fortfarande svårt att redogöra för cardiomyocyte polyploidization som bidrar upp till ~ 65% av cardiomyocyte DNA-replikation 13. Därför att bistå i korrekt kvantifiering av cardiomyocyte generation har vi utvecklat ett protokoll som gör att den robusta kvantifiering av andelen neo cardiomyocyte kärnor medan exklusive DNA-replikation som resulterar i ökad ploiditet. Även om detta protokoll kan inte diskriminering mellan neo-cardiomyocyte släktention och cardiomyocyte bi-kärnbildning, kan den användas snabbt och noggrant beräkna den övre gränsen (som står för ploiditet) av cardiomyocyte generation. Detta protokoll ger därför en screeningmetod för att bedöma eventuella förändringar i andelen cardiomyocyte generation och polyploidization i sjukdomsmodeller eller utvärdera den potentiella effektiviteten av läkemedel. När förändringar i graden av neo-cardiomyocyte kärnor generation identifieras med hjälp av detta protokoll efterföljande studier kan användas för att fastställa om detta beror på förändringar i cardiomyocyte generation cardiomyocyte kärnnummer, som tidigare beskrivits 2,13,17,18. Dessa inkluderar användning av histologiska kvantifiering cardiomyocyte kärnbildningsdynamik under pulsperioden eller analyser av vävnadssnitt erhållna från edu pulsade djur i att jämföra edu inkorporering i de mononukleära och multinukleära cardiomyocyte populationer.
På grund av de låga nivåerna av cardiomyocyte omsättning iProtokollet använder flera injektioner av edu under en 7-dagarsperiod. Detta gör också att "jaga" av alla potentiella cellulära källor cardiomyocyte generering och tillåter kvantifiering av kumulativ cardiomyocyte kärnor generation under denna tidsperiod. Beroende på studien, kan denna tidsram justeras för att passa de beräknade nivåer av cardiomyocyte generation. För en noggrann kvantifiering av edu inkorporering i cardiomyocyte kärnor, är det absolut nödvändigt att det inte finns någon icke-specifik märkning av kärnorna med den sekundära antikroppen används för att detektera PCM-1 reaktivitet. Det skulle därför vara klokt att vidta ytterligare sekundära antikroppstiter experiment för att optimera denna aspekt av protokollet, särskilt om en annan än den som sekundär antikropp som föreslås i detta protokoll ska användas. Protokollet som beskrivs här använder PCM-1 uttryck för att identifiera cardiomyocyte kärnor. Även om detta är en etablerad cardiomyocyte markör, kan alternativa markörer användas för att valideradata; dessa inkluderar antikroppar som är specifika för hjärt Troponin T som har identifierats som delvis lokaliserad i cardiomyocyte kärnor 1. På liknande sätt kan alternativa kärn lokaliserade proteiner användas för att identifiera och kvantifiera edu ingå i andra än de cardiomyocytes kärnor populationer. Det är viktigt att alla cardiomyocyte kärnor som aktivt genomgår mitos exkluderas från analysen, eftersom ödet för detta DNA-syntes är okänd och kan resultera i antingen celldelning eller ökad ploiditet. PCM1 demonteras under M-fasen av cellcykeln därför kardiomyocyter genomgår mitos kommer inte identifieras genom PCM1 expression. Dessutom bör alla kärnor i S-fasen av cellcykeln uteslutas från efterföljande analys. Detta kan åstadkommas genom att grinda ut alla kärnor med en DAPI intensitet ovanför 2N befolkningen, däribland dem med en DAPI intensitet mellan 2N och 4N populationer.
Även om det är mer och meraccepterade att hjärtat har kapacitet att ersätta kardiomyocyter under normalt åldrande och efter akut skada förblir källan och graden av denna potential kontroversiell. Dessutom har disparata andelen cardiomyocyte omsättning rapporterats 1,7,20-22. Detta kan delvis bero på svårigheterna att exakt identifiera och kvantifiera neo-cardiomyocyte generation 19. Till dags dato har de flesta studier har förlitat sig enbart på användningen av histologisk analys och identifiering av kardiomyocyter via expressionen av cytoplasmiska proteiner, innefattande proteiner av sarcomere, för kvantifiering av cardiomyocyte omsättning och förnyelse 2,4,23,24. Användningen av dessa metoder för att detektera uttrycket av proliferationsmarkörer, eller såsom visas här, kan inkorporeringen av tymidinanaloger lätt resultera i felaktig identifiering av andra typer cardiac cell såsom kardiomyocyter. Även om användningen av 3D-konfokal avbildning kan bidra till att lindra dessa problem these metoder är dyra och tidskrävande. Intressant, det protokoll som beskrivs här visar neo-cardiomyocyte kärnor generation sker med en hastighet på 0,17% per vecka. Detta överensstämmer med andra flödescytometri baserade studier som visar veckoomsättningshastigheter på upp till 0,13% 5. Även om det är frestande att extrapolera årliga omsättningshastigheter baserade på dessa data, som i tidigare studier 2,5,25,26, är detta olämpligt, eftersom hastigheterna av omsättningen är dynamiska under livstiden för ett djur 13.
Denna metod har ett antal potentiella applikationer, inklusive bedömning av de potentiella läkemedel för att förbättra cardiomyocyte regenerering eller att undersöka effekterna av hjärtsjukdom på cardiomyocyte omsättning och andelen cardiomyocyte polyploidization.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
| 2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
| cell strainers 70 μm and 100 μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
| CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
| Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
| ultracentrifuge | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J.
- Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
- Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
- Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
- Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205 (2012).
- Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288 (2014).
- Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Bergmann, O., et al.
- Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
- Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
- Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
- Kajstura, J., et al.
- Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
- Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J.
- Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473 (2015).
- Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).
