Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Summary

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Abstract

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Introduction

Metástasis representan más del 90% de las muertes causadas por tumores sólidos. El hueso es el órgano más frecuentemente afectado por la metástasis de varios tipos de cáncer, especialmente de mama y de próstata. Cuando se diagnostica en la clínica, las metástasis óseas por lo general ya han entrado en etapas avanzadas, ya sea con o osteolíticas osteoblásticas alteraciones en el hueso, a menudo acompañadas con síntomas neurológicos.

Los estudios anteriores se centraron principalmente en las metástasis óseas osteolíticas abiertas ^1-3, sin embargo, actualmente hemos comprensión de micrometástasis en los huesos limitado antes de la aparición del proceso de osteolítica. Esto es al menos en parte debido a la falta de modelos y enfoques experimentales apropiadas. Modelos de ratones genéticamente modificados de cáncer de mama a menudo metástasis a los pulmones, pero mucho menos eficientemente a los huesos ^4. Del mismo modo, los tumores trasplantados ortotópicamente raramente desarrollan metástasis óseas espontáneas, con un poco de 4T1 carcinom mamaria hueso-tropicaluna sub-clones y MSP sobreexpresa PYMT modelo de ratón transgénico como excepciones ^5-7. Perforación Intra-tibial puede entregar las células del cáncer a los huesos ^8-10, sino que también incurre en el daño y la inflamación de los tejidos locales. Actualmente inyección intracardiaca de líneas celulares de cáncer de mama ha sido el enfoque principal para investigar la colonización hueso ^11-13. Sin embargo, después de las células cancerosas se introducen en ventrículo izquierdo sólo una proporción limitada finalmente alcanzará hueso y médula ósea, lo que hace difícil realizar un seguimiento de metástasis microscópicas de una forma cuantificable.

En este estudio, hemos establecido una técnica, a saber, la arteria intra-ilíaca (IIA) de inyección ^14, para entregar selectivamente las células cancerosas en los tejidos de las extremidades traseras, enriqueciendo así las células cancerosas en la médula y la médula ósea sin causar daño a los tejidos locales. Debido a la especificidad de hueso, este enfoque también permite tiempo suficiente para que las células de cáncer indolente para colonizar el tiempo antes de la unaimals sucumben a los tumores primarios o metástasis en otros órganos vitales. Cuando se combina con una variedad de otras técnicas, tales como imágenes de bioluminiscencia, la tinción de inmunofluorescencia y la histomorfometría ósea, la inyección IIA es potencialmente útil para una amplia gama de fines de investigación relacionadas con la metástasis en los huesos, especialmente el seguimiento de la progresión de las células cancerosas individuales a múltiples celdas micrometástasis. En particular, hemos demostrado que la inyección IIA nos permite visualizar las interacciones entre las células de cáncer y varios tipos de células que rodea en el microambiente de la médula.

Protocol

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo a las directrices del cuidado de animales de la Facultad de Medicina Baylor. 1. Preparación de la célula Nota: Las diferentes líneas celulares de cáncer se pueden utilizar para la inyección IIA dependiendo de los propósitos de investigación. Hemos utilizado líneas celulares de cáncer de mama MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 y línea celular de cáncer de próstata C4-2 en nuestra inv…

Representative Results

La Figura 1 ilustra la localización anatómica y la relación de la arteria ilíaca común (rojo) y la vena (azul). La figura 2 muestra la posición relativa de los vasos ilíacos y nervios en el microscopio de disección. Como se representa en la figura 2A, los vasos y los nervios están justo debajo de la pared peritoneal y pueden ser reveladas después de la incisión de l…

Discussion

Aunque sólo la arteria ilíaca es el objetivo de la inyección de las células cancerosas, se recomienda la separación de ambos vena iliaca y la arteria de los tejidos circundantes, y para levantarlos juntos como un paquete. Esto se debe a la vena y la arteria ampliamente contacto entre sí, y la pared del vaso venoso es delgada y es fácil de romper. Por lo tanto, para que una inyección de éxito, que ahorra tiempo y esfuerzo para sostener los dos vasos juntos, aunque se inyectan células cancerosas sólo a la arter…

Materials

Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45uM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552