Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

Summary

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Abstract

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Introduction

Metástases representam mais de 90% das mortes causadas por tumores sólidos. O osso é o órgão mais comum afectado por metástases de vários tipos de cancro, especialmente cancros da mama e da próstata. Quando diagnosticado na clínica, metástases ósseas geralmente já entraram estágios avançados com qualquer osteolíticas ou osteoblásticas alterações nos ossos, muitas vezes acompanhados com sintomas neurológicos.

Estudos anteriores predominantemente focado nas metástases ósseas osteolíticas evidentes ^1-3, no entanto atualmente temos a compreensão de micrometástases em ossos limitado antes do início do processo de osteolítico. Isto é, pelo menos em parte devido à falta de modelos e abordagens experimentais adequadas. Modelos de ratos geneticamente modificada de cancro da mama frequentemente metastizar para os pulmões, mas muito menos eficientemente aos ossos ^4. Da mesma forma, os tumores ortotopicamente transplantados raramente desenvolvem metástases ósseas espontâneas, com alguma 4T1 carcinom mamária osso-tropicaluma sub-clones e MSP overexpressed modelo de rato transgénico PyMT como exceções ^5-7. Perfuração intra-tibial pode entregar células cancerosas para o osso ^8-10, mas também incorre danos e inflamação de tecidos locais. Atualmente injecção intra-cardíaca de linhas celulares de cancro da mama tem sido a principal abordagem para investigar a colonização óssea ^11-13. No entanto, depois de as células cancerosas são introduzidos no ventrículo esquerdo apenas uma proporção limitada vai finalmente chegar osso e medula óssea, o que torna difícil controlar metástases microscópicas de um modo quantificável.

Neste estudo, nós estabelecemos uma técnica, ou seja, intra-arterial ilíaca (IIA) de injecção ^14, para entregar seletivamente as células cancerosas nos tecidos dos membros posteriores, enriquecendo assim a célula de câncer nos ossos e medula óssea, sem causar danos aos tecidos locais. Por causa da especificidade do osso, esta abordagem também permite tempo suficiente para que as células cancerosas indolentes para eventualmente colonizar antes a umsucumbir a animais produtores de tumores primários ou metástases em outros órgãos vitais. Quando combinado com uma variedade de outras técnicas, tais como a imagiologia bioluminescente, imunofluorescência e a histomorfometria óssea, AII injecção é potencialmente útil para uma ampla gama de efeitos de pesquisa relacionadas com metástases ósseas, especialmente para controlar a progressão de células cancerígenas único de multi-célula micrometástases. Em particular, foi demonstrado que AII injecção permite visualizar as interacções entre as células cancerosas e vários tipos de células circundante no microambiente do osso.

Protocol

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as orientações de cuidados de animais da Baylor College of Medicine. 1. Preparação de células NOTA: As linhas de células de cancro diferentes podem ser usadas para injecção AII dependendo fins de investigação. Temos usado linhas celulares de cancro da mama MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 e linha de células de cancro da próstata C4-2 em nossa pesquisa. Normalmente usamos tanto vaga-lume c…

Representative Results

A figura 1 ilustra a localização anatômica e relação de artéria ilíaca comum (vermelho) e veia (azul). A Figura 2 mostra a posição relativa dos vasos ilíacos e nervos sob microscopia de dissecção. Como representado na Figura 2A, os vasos e nervos estão bem abaixo da parede peritoneal e pode ser revelado após a incisão na pele é feita e o peritônio é empurrado…

Discussion

Embora apenas a artéria ilíaca é alvo de injeção de células cancerosas, recomendamos a separação de ambos veia ilíaca e artéria dos tecidos circundantes, e para levantá-los juntos como um pacote. Isto é porque a veia e a artéria extensivamente contactar uns com os outros, e a parede do vaso venoso é fina e é fácil de quebrar. Portanto, para uma injeção de sucesso, ele economiza tempo e esforço para segurar os dois navios juntos, embora as células cancerosas são injectados apenas para a artéria. Uma…

Materials

Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45uM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552