Summary
Dit manuscript beschrijft de protocollen voor prostaat micro-dissectie en chirurgische castratie in het laboratorium muis. We tonen ook representatieve resultaten van deze protocollen. Tenslotte bespreken we de voordelen en het gebruik van deze protocollen.
Introduction
De prostaat is de meest voorkomende plaats van kanker bij mannen in de Verenigde Staten. Bijna 220.000 mensen elk jaar zal worden gediagnosticeerd met prostaatkanker, en ongeveer 27.000 mensen zullen bezwijken aan hun ziekte 1. Mannen hebben een 1 op 7 levensduur van het risico van een diagnose van prostaatkanker in de Verenigde Staten 1. Goedaardige prostaathyperplasie (BPH), een leeftijdsgebonden goedaardige prostaatvergroting, is een wijdverspreide aandoening, die meer dan 80% van de mannen boven 80 2. Als zodanig, de prostaat is de focus van veel onderzoek.
Muismodellen zijn op grote schaal gebruikt om ziekten van de prostaat 3 te bestuderen. Kortom, de muis prostaat is een uitstekende vertegenwoordiger van de menselijke klier 4, maar er zijn overeenkomsten en verschillen tussen muis en menselijke prostaat anatomie en fysiologie 5. Bij beide soorten is de prostaat aan de onderkant van de blaas, rond de urethra. De menselijke prostaat is een lozijn verdeeld in vier zones: centraal, overgang, perifere en anterior fibromusculaire stroma. In tegenstelling, de muis prostaat bestaat uit drie gekoppelde lobben op verschillende plaatsen rondom de urethra: voorste, ventraal en dorsolaterale. Op cellulair niveau is het belangrijkste verschil is dat de basale cel luminale celverhouding in mens is ongeveer 1: 1, maar is 1: 4 bij muizen 6. De muizen stroma is ook verschillend in muizen ten opzichte van de mens - de mens uitgebreidere gladde spieren, terwijl de spierlaag veel dunner murine prostaat. De juiste identificatie, ontleding, en de behandeling van de muis prostaat essentieel muis prostate onderzoek.
Hormoonspiegels drastische invloed op de ontwikkeling en homeostase van de prostaat bij zowel mensen en muizen. Hoewel oestrogeen lijkt een rol te spelen in prostate ontwikkeling 7, het belangrijkste hormoon in de prostaat wordt testosteron. Testosteron is essentieel voor de ontwikkeling van een glandulard onderhoud. Na zowel fysische of chemische castratie, ongeveer 90% van de luminale cellen in de volwassen prostaat apoptose en de klier krimpt. Als testosteron opnieuw aan een individu onder castratie omstandigheden, de prostaat kan zichzelf regenereren op volle capaciteit. Testosteron lijkt ook prostaatkanker, daarom androgeendeprivatietherapie is een algemeen gebruikte therapeutische strategie rijden. Veel prostaatkanker resistent geworden androgeendeprivatie. Bovendien, mannen die androgeen deprivatie therapie voor behandeling van prostaatkanker ondergaat cycli gecastreerde en geregenereerd omstandigheden. In de muis, chirurgische castratie, samen met hormonale regeneratie van de prostaat herinvoering van testosteron, is een belangrijk instrument om castratie weerstand en de effecten van testosteron fietsen op de prostaat bestuderen.
In dit artikel zullen we bespreken en tonen de juiste technieken waarmee aan Locate en micro-ontleden muis prostaat, en operatief castreren muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol voldoet en volgt de door de Johns Hopkins University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtsnoeren.
1. Micro-ontleden a Mouse Prostaat
- Euthanaseren de muis door kooldioxide stikken of er een alternatief goedgekeurd methode in overeenstemming met de institutionele dierlijke zorg en het gebruik richtlijnen.
- Speld de muis in een liggende positie om een dissectie bord door een pin door middel van elk van de vier poten.
- Spray de buik met 70% ethanol.
- Houd de huid van de onderbuik met een pincet en een schaar door de huid te snijden en peritoneum ongeveer 1 cm juist voor de opening van de penis, voorzichtig alle organen niet te snijden.
- Weggesneden en de huid peritoneum van de onderbuik, op beide zijden van de buik om de ribbenkast, waardoor de peritoneale holte.
- Identificeer de blaas en urogenitale kanaal en blootstellen door voorzichtig bewegen vet en andere organen opzij.
- Using tang, greep de zaadleider aan de basis in de buurt van de plasbuis, en scheur het weg.
- Herhaal dit met de andere zaadleiders.
- Met behulp van pincet voorzichtig grip blaas en trek het, tegelijkertijd met een schaar door de urethra onder de blaas en ventrale prostaat (ongeveer 1 cm onder de basis van de blaas) te snijden.
Opmerking: Als de blaas wordt getrokken, zal de gehele urogenitale kanaal (bevattende blaas, een deel van de urethra, prostaat alle lobben en de zaadblaasjes) met zich meebrengt. Er kan enige weerstand. - Plaats het urogenitale kanaal (UGT) in een 60-100 mm petrischaal met ongeveer 5-10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voer de rest van het protocol onder een dissectie microscoop. Gebruik twee fijne tang, één in elke hand. Houd de tang "als een potlood" en rust de onderarmen op de bank top om hen te stabiliseren.
- Gebruik fijne tang om de positie van de UGT, zodanig dat de blaasgeplaatst, wordt de urethra naar beneden gericht, en de zaadblaasjes zijn aan weerszijden van de blaas.
- Pak de plasbuis met een pincet en trek weg vet met de andere tang zonder scheuren weg enige prostaatweefsel. Let op: Fat zal "shiny" ten opzichte van het omringende weefsel verschijnen.
- Zodra het vet wordt verwijderd, een tang om het bindweefsel tussen de ventrale lobben van de prostaat scheuren en ze te scheiden.
- Om een van de ventrale lobben te verwijderen, gebruikt u een tang om grip één ventrale kwab in de buurt van de top, en gebruik de andere tang om grip die kwab aan de basis zo dicht mogelijk bij de plasbuis mogelijk. Terwijl de basis van de lob vastgrijpen gebruik de andere tang te grijpen de urethra. Trek de kwab weg van de plasbuis met een stevige, vloeiende beweging. Zorg ervoor dat er geen prostaatweefsel blijft verbonden aan de plasbuis. Plaats de lob in het geschikte medium, afhankelijk van de volgende experimentele stap.
- Om vast te stellen en paraffine-inbedding van de svoldoende voor histologische analyse, plaatst u de kwab in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) 8.
- Plaats de kwab in de vrieskou medium, zoals oktober, voor cryopreservatie en snijden 8.
- Leg de kwab in koude PBS voor enkele cel isolatie voor cultuur of flowcytometrie 9.
- Herhaal stap 1,15 de andere ventrale lob.
- Om een van de voorste lobben te verwijderen, een tang om trek de kwab weg van de zaadblaasjes, zorg ervoor dat niet aan de zaadblaasjes doorboren. Zodra de lob onafhankelijk van de zaadblaasjes, verwijderen op dezelfde manier als de ventrale lob in stap 1.15.
- Herhaal stap 1,17 de andere voorkwab.
- Flip de resterende urogenitale kanaal boven zodat de dorsale prostaat zichtbaar.
- Om een van de dorsolaterale lobben te verwijderen, een tang om het bindweefsel tussen de twee dorsolaterale lobben en ook het bindweefsel tussen de lobben en t scheurenhij posterior regio van de zaadblaasjes. Verwijder de lob op dezelfde wijze als de ventrale lob in stap 1.15.
- Herhaal stap 1,20 de andere dorsolaterale kwab.
2. chirurgische castratie
Let op: Dit is een survival operatie, dus asepsis, anesthesie en pijnbestrijding zijn belangrijk voor de ethische en succesvolle afronding van dit protocol. Volg alle institutionele dierlijke zorg en het gebruik richtlijnen. Een externe warmtebron, zoals een recirculerende water deken tijdens de chirurgische ingreep om onderkoeling te voorkomen. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor gebruik in de chirurgie.
- Op een schone, steriele oppervlak verdoven de muis met behulp van passende maatregelen (bv 2% geïnhaleerd isofluraan) en de positie van de mOuse in een liggende positie. Opmerking: Alternatieve anesthesie methoden, zoals ketamine, kunnen eveneens worden gebruikt, afhankelijk van het goedgekeurde protocol dier.
- Controleer reflexen van de muis door knijpen de tenen. Als de muis niet reageert, ga dan naar de volgende stap. Als het reageert, wacht 1-3 min en opnieuw controleren. Scheer de chirurgische gebied met een elektrisch scheerapparaat.
- Aseptisch bereiden de buik van de muis met behulp van afwisselende scrubs van 70% ethanol en jodium of procedures aanbevolen door de institutionele veterinaire personeel of IACUC.
- Met behulp van een steriel scalpel een 1 cm verticale incisie door de huid in de middellijn van de onderbuik, ongeveer 1,5 cm ventraal van de penis.
- Maak een kleine incisie (<1 cm) door middel van het buikvlies, voorzichtig om geen organen te snijden.
- Met behulp van een steriel pincet, pak de gesneden rand van het buikvlies en til het voorzichtig op, zodat zij in staat om de buikholte eronder te zien.
- Met behulp van een andere steriel pincet, bereiken in the peritoneale holte en grip links of rechts testicular vetkussentje, lateraal van de blaas. Trek de vetkussentje door de opening in het peritoneum en de huid tot de testis komt ook. Wees voorzichtig om geen andere weefsels of organen verwonden tijdens deze stap.
- Met behulp van een cautery pen, dwars door het vet pad dat houdt de testis. Snijd langzaam door de testis slagader met de cauterisatie pen Opmerking: Als de testis slagader te snel wordt gesneden, kan er te veel bloeden en de muis kan moeten worden gedood.
- Zodra het vet pad en slagader worden gesneden, verwijder de testis en vet pad.
- Herhaal stap 2,6-2,9 met andere testis. Opmerking: Een alternatieve methode voor het verwijderen van de testes is operatief ligeren de testiculaire ader, gevolgd door het snijden van het vaartuig met een schaar.
- Hechten het buikvlies afgesloten met absorbeerbare hechtdraad.
- Staple de huid gesloten met chirurgische wond clips.
- Dien een pijnstiller om pijn te beheren, en de plaatsde muis in een schone kooi een kooi warmere gedurende 5-10 min. Bewaken van de muis op tekenen van pijn of bloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle zes prostaat lobben werden verwijderd uit de muis via prostaat micro-dissectie (figuur 1). Totale urogenitale kanaal (UGT) bestaat uit alle lobben prostaat, de blaas, zaadblaasjes en de urethra (figuur 1a). De zaadleider hecht aan de urethra, maar is niet nodig voor de prostaat micro-dissectie, en kan dus vóór verwijdering van de UGT worden losgemaakt door het snijden van de plasbuis (figuur 1b-1c). Het urogenitale kanaal zullen samen blijven nadat het is verwijderd uit de buik (figuur 1d). Op dit punt blijft het UGT bedekt met vetweefsel, die moet worden verwijderd om toegang tot de prostaat lobben (Figuur 1e) krijgen. Alle zes lobben (ventrale anterieur en dorsolaterale paren) zichtbaar rond de urethra bij de basis van de blaas. Pure prostaatweefsel kan dan worden verwijderd na het bovenstaande protocol (Figuur 1f). Deze lobben kanin het geschikte medium voor verdere analyse worden geplaatst.
Castratie de verwijdering van de testes, die de belangrijkste producenten van testosteron. Testosteron is aanwezig in de muis tot castratie plaatsvindt, waarna de prostaat regresses (Figuur 2a). Hormonale regeneratie via herinvoering van testosteron kan castratie (Figuur 2b) te volgen. We voerden castratie, gevolgd door twee cycli van hormonale regeneratie en testosteron niveaus in muizenserum werden gecontroleerd met ELISA (Figuur 3). Onder castratie omstandigheden, testosteron vrijwel verdwijnen. Alternatief tamoxifen (een selectieve oestrogeen receptor modulator) vertoont geen significant verschil met de hormonaal normale toestand. Na castratie, testosteron werd opnieuw geïntroduceerd in de muis, waardoor testosteronniveaus spike sterk (figuur 3). Vervolgens hebben we micro-ontleed de prostaat lBLE van de muizen en afgebeeld als aparte voorste kwabben (figuur 4a). We hebben ook formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde, en coupes van het weefsel. Figuur 4b toont hematoxyline en eosine gekleurde anterior prostaatweefsel onder normale, gecastreerd, en geregenereerd omstandigheden. Gecastreerde prostaat lobben krimpen tot een tiende van de grootte van een normale prostaat benaderen, en dat hormonale regeneratie herstelt de prostaat de oorspronkelijke grootte.
Figuur 1: Bruto histologie van de Prostaat Micro-dissectie protocol. (A) De urogenitale kanaal (UGT) in zijn natuurlijke staat, blootgesteld in het muizen buik. De stippellijnen omvatten de verschillende onderdelen van de UGT, waaronder de zaadblaasjes (SV), prostaat lobben (ventrale prostaat (AP) en ventrale prostaat (VP) zichtbaar hier), blaas (B) en urethra (gelegen zijnNeath de blaas). De zaadleider (VD) is ook zichtbaar. (B) de zaadleiders zijn verwijderd. De pijl wijst naar de regio waar de vas deferens is verwijderd. (C) De UGT is uit de buik verwijderd door snijden van de urethra onder de ventrale prostaat lobben. (D) De UGT is in PBS geplaatst en wordt gezien onder een dissectie microscoop. (E) vet is verwijderd uit de UGT, waardoor de zichtbaarheid van alle zes lobben van de prostaat. De pijlen wijzen naar de twee voorste kwabben, de ventrale lobben en de dorsolaterale lobben. (F) Alle zes individuele prostaat lobben zijn verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: TimEline voor Castratie en hormonale Regeneration. (a) Testosteron aanwezig bij fysiologische niveaus tot castratie is, wanneer testosteron verdwijnt en regressie van de prostaat begint. (B) Castratie verwijdert testosteron tot testosteron wordt heringevoerd, waardoor hormonale regeneratie van de prostaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Testosteron in diverse hormonale voorwaarden Testosteron ELISA onder tamoxifen behandeld, hormonaal normaal, gecastreerd en hormonaal geregenereerd omstandigheden. Geregenereerde x 2 betreft implantatie en verwijdering van synthetische testosteron, gevolgd door implantatie van een tweede synthetische testosteron. Error bars vertegenwoordigt standaard afwijking. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Prostaat Appearance onder Castratie en Regeneration Voorwaarden (a) bruto uiterlijk van anterieure prostaat lobben onder gecastreerd, hormonaal normaal, en hormonaal geregenereerd omstandigheden.. Geregenereerde x 2 betreft implantatie en verwijdering van synthetische testosteron, gevolgd door implantatie van een tweede synthetische testosteron. (B) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde anterieure prostaat lobben doorgesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine. Klik hier om een grote te bekijkenr versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostate micro-dissectie maakt kwab-specifieke experimenten en analyses van de muis prostaat (Figuur 1). Door genetisch muismodellen kan fenotypes worden gezien in een lob die niet wordt gezien in andere. Ook voor histologische analyse, dit protocol verzekert dat de maximale hoeveelheid zuiver prostaatweefsel kan worden doorgesneden en gekleurd zonder andere urogenitale weefsels in de sectie. Tot slot, voor single-cell experimenten, dit protocol zorgt voor isolatie van bijna zuiver prostaatcellen. Epitheelcellen verrijking kits kunnen verder zuiveren prostaatcellen van stromale cellen. Beperkingen aan micro-dissectie omvatten het gebruik van een dissectie microscoop, en de leercurve die nodig zijn om fijne tang te gebruiken terwijl u door de dissectie microscoop. Alternatief kan prostaatweefsel coupes voor histologie kader van de UGT, waardoor micro-dissectie overbodig. Echter, de keerzijde van snijden de gehele UGT is datandere weefsels aanwezig in het gedeelte, waardoor het niet zo schoon. Bovendien, voor het genereren van één prostate celpopulaties de lobben worden gescheiden van de UGT om besmetting te voorkomen.
Chirurgische castratie is een fundamenteel chirurgie voor vele prostate onderzoekslaboratoria en is essentieel voor de studie van de effecten van testosteron op de prostaat ontwikkeling en ziekte. Dit protocol is snel (typisch moment van de operatie van een ervaren gebruiker ongeveer 5 min) en verwijdert bijna 100% van testosteron uit omloop (figuur 3). We merken op testosteron niveaus in muizen verschillen aanzienlijk en kan variëren met maar liefst 30-voudige van muis tot muis 10. Castratie verwijdert deze variatie. Na castratie, kunnen onderzoekers besluiten om testosteron terug toe te voegen aan de prostaat (figuren 3-4) te regenereren. Dit kan door subcutaan implanteren van een bron van testosteron, zoals een osmotische pomp, een testosteronpellet, of een semi-permeabel silastic buis met testosteron poeder 8. Afhankelijk van de hoeveelheid testosteron toegevoegd, kan deze procedure fysiologische bieden aan testosteron in het bloed (Figuur 3) superphysiological. Dit protocol kan ook gebruikt worden om prostaatkanker cellijn te bestuderen en stamcel biologie 11. Een andere optie is chemische castratie of androgeendeprivatietherapie via behandeling van muizen met verbindingen die de productie van testosteron remmen, zoals dutasteride 12. Dit bootst een gemeenschappelijke behandeling van prostaatkankerpatiënten, die zelden operatief gecastreerd. Echter, chirurgische castratie een betrouwbare, duurzame manier voor het verwijderen van vrijwel alle testosteron. Het is belangrijk om te overwegen dat de bijnieren ook synthetiseren androgeen soorten zoals androsteendion en dehydroepiandrosteron, die kan worden omgezet in testosteron, maar in veel kleinere hoeveelheden, ten opzichte van de testes13. In sommige gevallen, de bijnieren kan ook operatief verwijderd, maar deze procedure is moeilijker.
Kortom, deze twee protocols zijn nuttig voor een groot aantal onderzoek naar prostaatziekten, en hormonale studies. Deze protocollen zijn een betrouwbare en consistente manier om prostate biologie analyseren hormonaal normaal, gecastreerd of hormonaal geregenereerd omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Sommige van de cijfers in dit manuscript waren royaal door het laboratorium van Bart O. Williams. De auteurs worden ondersteund door National Cancer Institute verleent U54CA143803, CA163124, CA093900, en CA143055.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
