في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة
Summary
للكشف عن الخلايا السليمة في الحيوانات كلها التي تحتوي على مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، تم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي حساسة للغاية المعينة CaspaseTracker لذبابة الفاكهة. تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي التي تعتمد على كاسباس في الخلايا السليمة عاش فترة طويلة في جميع أنحاء الأعضاء الداخلية للحيوانات الكبار تربى في ظل ظروف الأمثل في ظل غياب المحفزات الموت.
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
Caspases هي البروتياز السيستين التي تتوسط موت الخلايا أفكارك التي كتبها الشق العديد من البروتينات داخل الخلايا بعد مخلفات اسبارتاتي الرئيسية. على سبيل المثال، caspases البادئ تفعيل caspases المستجيب، nucleases الحمض النووي derepress، مكونات هيكل الخلية يلتصق وتغير تكوين الدهون أغشية الخلايا لتفكيك بسرعة الخلايا وتحفيز الاعتراف بها والغمر من الخلايا التي تتخلص من الجثث الخلية المجاورة. 1-4 ويقدر أن المليارات من الخلايا تموت يوميا في جسم الإنسان، وموت الخلايا المبرمج هو آلية هامة من موت الخلايا السرطانية الناجمة عن العلاج الكيميائي. 5 مجموعة مختلفة من caspases يمكن أن يسبب موت الخلايا عن طريق العمليات غير أفكارك واضحة لتنشيط المناعة الفطرية. 6 لذلك، وقد ركزت معظم البحوث حول caspases على وظائف الموالية للموتهم.
ومن المثير للاهتمام، كشفت أدلة في وقت مبكر في الحقل الذي نفس caspases المسؤولة عن تعزيز موت الخلايا أيضا غير الموت وunctions. وقد أثبتت الدراسات الرائدة التي caspases يشاركون في الوظائف الخلوية المتنوعة في الخلايا السليمة، بما في ذلك تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة خلال مرحلة التطور الجنيني. مطلوبة 7-9 Caspases لتفريد النطف في ذبابة الفاكهة 10،11، من أجل الحيلولة دون وnecroptotic مسار موت الخلايا البديل في الفئران 12،13، وتجهيز الرنا الميكروي في C. ايليجانس. 14،15 في ربما تورط الأطول عمرا الخلايا، الخلايا العصبية، caspases والآلات أفكارك أخرى في تنظيم نشاط الخلايا العصبية عن طريق تقليم النهايات متشابك، وهي عملية يعتقد أنه ضروري لتعزيز نقاط الاشتباك العصبي الأخرى للتعلم والذاكرة. 16- 18 فمن الممكن أن caspases تسهل التقليم متشابك من نوع مصغرة موت الخلايا المبرمج للتوقعات العصبية صغيرة دون موت الخلايا كله. 19 ومع ذلك، caspases قد يكون لها وظائف بديلة لا علاقة لها بأحداث مثل موت الخلايا المبرمج. 20،21 الدور المزدوجفي الحياة والموت ليست فريدة من نوعها لcaspases. بي سي إل-2 البروتينات الأسرة والسيتوكروم ج لها أدوار في قطاع الطاقة الخلوية في الخلايا السليمة ولكن هي أيضا جزء من مسار أفكارك الأساسية التي يتم تفعيلها من خلال أنواع كثيرة من الإجهاد خلية 22-25 على الرغم من أن لم يثبت، فإنه يبدو من المنطقي أن تطور ربطت اليوم -jobs إلى الموت فرصة عمل خلال نفس الجزيئات لضمان القضاء في الوقت المناسب من الخلايا غير صالحة أو غير مرغوب فيها.
في الوقت الحاضر، ليست مفهومة الآليات الجزيئية النشاط كاسباس غير أفكارك، وأيضا لا يعرف مدى النشاط كاسباس غير أفكارك أثناء التطور الجنيني وفي أنسجة البالغين. ويتمثل التحدي الرئيسي هو صعوبة في التمييز أيام عمل من الموت ظائف caspases. وعلى النقيض من الخلايا وpyroptosis، عندما يتم تضخيمه النشاط كاسباس التي كتبها شلال بروتين، ومن المتوقع أن تحدث على مستويات أدنى من النشاط الأنزيمي، على الأرجح دون الكشف عن العديد من ميتاليك يتوفر-وظائف اليوم من caspasesاذكر.
قبل العمل المقدم هنا، وضعت غيرها من مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار كاسباس لأغراض مختلفة. وأجهزة الاستشعار SCAT (على سبيل المثال، ECFP-DEVD-الزهرة) كشف بسرعة في الوقت الحقيقي النشاط كاسباس في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية باستخدام الحنق. 26،27 وبعد انشقاق كاسباس، شاردة GFP المستهدفة النووية من Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) يخضع لإعادة المركزية التحت خلوية في غضون دقائق عند المشقوق في البلازما غشاء حبل من caspases. 28 وبالمثل، ApoAlert-pCaspase3 الاستشعار (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes من العصارة الخلوية إلى النواة على الانقسام كاسباس. 29،30 أكثر في الآونة الأخيرة، وحامل اللون في iCasper تم هندستها بذكاء ليتألق عندما المشقوق من قبل caspases، والسماح الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في الوقت الحقيقي في الخلايا العصبية للأجنة ذبابة الفاكهة، ولكن في المقام الأول بالتعاون مع موت الخلايا التنموي. فاة 31 كاسباس التي تعتمد على الخلايا العصبية الشمية خلال الشيخوخة كان demonstقام بتقييمه المناعية الكشف عن شكل المشقوق كاسباس من أجهزة الاستشعار CPV (على سبيل المثال، mCD8-PARP فينوس). 32،33 الأهم من ذلك، تم الكشف عن شكل تفعيلها من كاسباس 3 في غياب موت الخلايا التي immunostain حساس في العمود الفقري لل الخلايا العصبية مثقف، وفي سوما باستخدام مضان تعتمد كاسباس من الصبغة مراسل CellEvent النووي، ولكن واجه صعوبات بسبب الصور سمية، على الرغم من موت الخلايا تأخر حتى بعد إزالة العمود الفقري. 19 وهكذا، هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار كاسباس جديدة للكشف عن وتعقب الخلايا مع النشاط كاسباس القاعدية في الجسم الحي.
للتغلب على هذه الصعوبات، ولدت لنا رواية المزدوج جهاز الاستشعار البيولوجي اللون كاسباس، المعين CaspaseTracker. هذه الاستراتيجية يجمع بين نسخة معدلة من ذبابة الفاكهة كاسباس الحساسة Apoliner جهاز الاستشعار البيولوجي 28 مع ذبابة الفاكهة G-TRACE نظام FRT recombinase 34 لتسمية بشكل دائم وتعقب الخلايا في الجسم الحي. <سوب> 35 نظام G-TRACE تنشيط GAL4-يسمح مستويات منخفضة جدا من caspases لتفعيل CaspaseTracker، مما أدى إلى التعبير طلب تقديم العروض في السيتوبلازم والتعبير GFP المستهدفة النووي دائم في أي خلية التي شهدت من أي وقت مضى النشاط كاسباس 35 يمكن هذا النظام تسمية الخلايا في جميع أنحاء الحياة في الحيوانات كلها باستخدام ذبابة الفاكهة، نظام نموذجي لين العريكة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة caspases وموت الخلايا. 36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا توضيح البناء والداخلية عمل من CaspaseTracker التي تسهل الكشف عن النشاط كاسباس القاعدية على نطاق واسع في الأنسجة السليمة. الخطوات الحاسمة للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك في الجسم الحي هي: 1) توليد الذباب مع التحوير جهاز الاستشعار البيولوجي، 2) التحقق من وظيفة م?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر POLAN سانتوس ودارين Obbard عن الرسوم التوضيحية ذبابة الفاكهة في الشكل. 2A، مارسيلو جاكوبس-لورينا لاستخدام insectary JHMRI. وأيد هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (فرقة العمل الرفيعة المستوى)، لجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة)، والمعاهد الوطنية للصحة منح NS096677، NS037402 وNS083373 (JMH). هو لام تانغ هو زميل مؤسسة Shurl وكاي كورتشي من مؤسسة أبحاث علوم الحياة.
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
Referências
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation – stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. . Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
