Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento

Resumo

Este manuscrito descreve um sistema modelo ex vivo composto de meios condicionados por órgãos derivados do linfonodo, osso, pulmão e cérebro de camundongos. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Resumo

O câncer de mama metastatiza preferencialmente para linfonodos, ossos, pulmão, cérebro e fígado em pacientes com câncer de mama. Esforços de pesquisa anteriores se concentraram na identificação de fatores inerentes às células de câncer de mama que são responsáveis por esse padrão metastático observado (denominado tropismo de órgãos), no entanto, muito menos se sabe sobre os fatores presentes em órgãos específicos que contribuem para esse processo. Isso se deve em parte à falta de sistemas de modelos in vitro que recapitulem com precisão o microambiente do órgão. Para resolver isso, foi estabelecido um sistema modelo ex vivo que permite o estudo de fatores solúveis presentes em diferentes microambientes de órgãos. Este modelo consiste na geração de meios condicionados a partir de órgãos (linfonodos, ossos, pulmão e cérebro) isolados de camundongos nus atímicos normais. O sistema modelo foi validado demonstrando que diferentes linhagens celulares de câncer de mama exibem comportamento maligno específico de linhagem celular e específico de órgão em resposta a meios condicionados por órgãos que correspondem ao seu potencial metastático in vivo. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar fatores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e de outros tipos de células cancerígenas, incluindo influências no crescimento, migração, comportamento semelhante ao tronco e expressão gênica, bem como a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos para o câncer. Este é o primeiro sistema modelo ex vivo que pode ser usado para estudar o comportamento metastático específico de órgãos em detalhes e avaliar o papel de fatores solúveis derivados de órgãos específicos na condução do processo de metástase do câncer.

Introdução

O câncer de mama é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em mulheres ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer ^1. alta taxa de mortalidade do câncer de mama é principalmente devido à falha da terapia convencional para reduzir e eliminar a doença metastática; aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer é atribuída a metástases ^2. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes da cascata metastática é fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, tanto precoce e cancro da mama de fase tardia.

A pesquisa passada ajudou a elucidar a natureza de várias etapas de metástase ....

Protocolo

Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care, no âmbito de protocolos aprovados pelo Uso de Animais Subcomissão Western University.

1. Isolamento de órgãos (pulmão, cérebro, ossos, gânglios linfáticos)

1. Prepare quatro tubos de 50 ml estéreis cónicos (um para cada órgão a ser isolado) contendo aproximadamente 30 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pré-pesam cada tubo de PBS utilizando uma balança eletrônica.
2. Eutanásia 6-12 semana rato velho por inalação de CO _2. Os ratos devem ser deixada na câmara de CO _2, dur....

Resultados

Geração de mídia com ar-Organ

Um diagrama / esquemática descrição geral do processo de isolamento de órgãos e geração de meios condicionados é apresentado na Figura 1, com imagens fotográficas representativos do processo mostrado na Figura 2. Deve notar-se que, quando este protocolo foi a primeira fase de desenvolvimento, fígado foi incluído em nossa análise, porque é um local.......

Discussão

A metástase é um processo complexo pelo qual uma série de eventos celulares são responsáveis ​​por invasão de tecido e tumor distante estabelecimento ^4,30,31. O sistema modelo ex vivo aqui apresentada pode ser utilizada para estudar dois aspectos importantes da progressão metastático: homing célula de cancro ou de migração de um órgão específico ( "chegar") e o crescimento neste órgão ( "crescendo lá"). Muitos estudos têm focado anteriormente na identificação de características mo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos cônicos de 50 ml	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Mantenha estéril
1x solução salina tamponada com fosfato	ThermoFisher Scientific	10010-023	Mantenha os camundongos nus estéreis
	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use às 6 - 12 semanas de idade Almofada de
espuma de poliestireno	N/A	N/A	A tampa descartada (~ 4 x 8 polegadas ou maior) de um contêiner de espuma de poliestireno pode ser usada para essa finalidade. Esterilize limpando com etanol.
Fórceps	Fine Science Tools	11050-10	Mantenha a tesoura estéril
de	Fine Science	14058-11	Mantenha as compressas de gaze estéreis
	Fisher Scientific	22-246069	Mantenha estéreis
placas de Petri de vidro de 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	estéreis
	Fisher Scientific	S95937A	Mantenha o DMEM estéril
:F12	Life Technologies	21331-020	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar, manter estéril
1x Mito + Extensor de Soro	BD Biosciences	355006	Referido como "suplemento mitógeno concentrado" no manuscrito. Mantenha a
Penicilina-Estreptomicina estéril (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Mantenha estéril
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar, manter estéril
Soro Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Mantenha a solução estéril
de tripsina/EDTA	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar, manter estéril
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Mantenha estéril
0,22 μ m filtros de seringa	Sigma-Aldrich	Z359904	Manter frascos de
cultura de tecidos T75	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Manter estéreis
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Manter estéril, usar para ensaios
de migração Anti-mouse Sca-1	R& D Systems	FAB1226P	uso em 10 µ células l/106
anti-rato CD105 R	& D Sistemas	FAB1320P	uso em 10 µ células l/106
anti-rato CD29 R	& D Systems	FAB2405P-025	uso em 10 µ células l/106
anti-rato CD73 R	& D Systems	FAB4488P	uso em 10 µ l/106 células
Anti-rato CD44 R	& D Systems	MAB6127-SP	uso em 0,25 µ g/106 células
Anti-rato CD45	eBioscience	11-0451-81	uso em 5 µ células l/106
anti-rato gp38	eBioscience	12-5381-80	use em 10 µ L/106 células
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Manter estéril
Matrizes de proteínas	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 matriz por condição de mídia (incluindo controle negativo), em triplicado

Ferramentas Mantenha as lâminas de bisturi estéreis