Поколение Органосохраняющие условных СМИ и приложений для изучения органоспецифической Влияния на рак молочной железы метастатическое поведение
Summary
This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.
Abstract
Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.
Introduction
Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемых рака у женщин и второе место среди причин , связанных с раком смертей 1. высокий уровень смертности от рака молочной железы является, главным образом, из-за отказа от традиционной терапии для смягчения и ликвидации метастазами; приблизительно 90% случаев смерти от онкологических заболеваний обусловлены метастазирования 2. Понимание основных молекулярных механизмов метастатического каскада имеет первостепенное значение для разработки эффективных терапевтических средств, как в раннем и рака молочной железы на поздней стадии.
Прошлые исследования помогли выяснить многоступенчатый характер метастазирования рака молочной железы , и он выдвинул гипотезу о том , что исход как прогрессии рака и метастазов во многом зависит от взаимодействия между раковыми клетками и принимающей среды 3. Клинические наблюдения показывают , что многие виды рака органа отображения тропизм, то есть., Склонность к метастазированию преимущественно к конкретным organs.In КАНе рака молочной железы, болезни пациента , как правило , распространяется или метастазирует 5 основных сайтов, в том числе кости, легких, лимфатических узлов, печени и головного мозга 4-6. Многие теории были разработаны, чтобы объяснить этот процесс, но лишь немногие из них выдержали испытание временем. Теория Юинга метастазирования, предложенный в 1920-х годах, выдвинул гипотезу thatthe распространение метастаз строго из-за механических факторов; в результате чего опухолевые клетки разносятся по всему телу нормальных определенных закономерностей физиологического кровотока и просто арестовывают в первом капиллярного ложа они сталкиваются с 7. В отличие от 1889 года "семена и почва" гипотеза Стивена Педжета предположил, что дополнительные молекулярные взаимодействия были ответственны за выживание и рост метастазов, в результате чего раковые клетки ( "семена") могут только утвердиться и proliferatein микросреды органов, которые производят соответствующие молекулярные факторы ( "почвы ") 8. Почти столетие спустя, Леонард Вайсс подвзял мета-анализ ранее опубликованных данных аутопсии и подтвердили предсказание Юинга, что многие метастатические опухоли, обнаруженные во время вскрытия были найдены в ожидаемых пропорциях, которые можно было бы ожидать, если метастатической тропизм орган был определен узорами кровотока в одиночку. Тем не менее, в manyinstances были сформированы на определенных участках , то можно было бы ожидать от предложенных механических факторов Юинга 9 меньше или больше метастаз. Эти счета и теории говорят о том, что специфические микросреды органа играют решающую роль в моделях распространения и последующего роста и выживания многих видов рака, включая рак молочной железы.
Прошедшие исследовательские усилия в основном сосредоточены на опухолевых клеток , полученных факторов и их вклад в тропности органов наблюдается в метастазирования рака молочной железы 10-12, однако мало исследований изучены факторы , полученные из микросреды органа , который может обеспечить благоприятную нишу для созданияот метастазов рака молочной железы. Во многом это связано с техническими проблемами изучения компонентов микросреды органа в пробирке.
Настоящая статья описывает всеобъемлющую систему исключая виво модель для изучения влияния растворимых компонентов лимфатических узлов, костей, легких и головного мозга на метастатической поведение клеток рака молочной железы человека. Предыдущие исследования подтверждены этой модельной системе, продемонстрировав , что различные клеточные линии рака молочной железы отображать линии клеток и специфический органоспецифический злокачественную поведение в ответ на орган-кондиционированной среды , что соответствует их в естественных условиях метастатического потенциала 13. Эта система модель может быть использована для выявления и оценки конкретных органов, полученных растворимые факторы, которые могут играть определенную роль в метастатической поведении рака молочной железы и других видов раковых клеток, в том числе факторов, влияющих на рост, миграция, стволовой как поведение и экспрессию генов, а также идентификациипотенциальные новые терапевтические мишени для рака. Это первая система естественных условиях модель ех , которая может быть использована для изучения органоспецифической метастатическое поведение в деталях и оценить роль органов , полученных растворимых факторов в продвижении процесса метастазирования рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метастазы представляет собой сложный процесс, в котором ряд клеточных событий , в конечном счете ответственны за вторжение ткани и отдаленным опухоли учреждения 4,30,31. Модель системы ех естественных условиях , представленные здесь могут быть использованы для изучения два ва?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, the Canada Foundation for Innovation (No. 13199), and donor support from John and Donna Bristol through the London Health Sciences Foundation (to A.L.A.). Studentship and fellowship support were provided by the Ontario Graduate Scholarship program (Province of Ontario, to G.M.P. and J.E.C.), the Canada Graduate Scholarship-Master’s program (to M.M.P), the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (to M.M.P., G.M.P and J.E.C.) and the Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit at the London Regional Cancer Program (to M.M.P., G.M.P., J.E.C. and Y.X.). A.L.A. is supported by a CIHR New Investigator Award and an Early Researcher Award from the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1X Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6-12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1 x Mito+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), (2014).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)–an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
