التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.
Abstract
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) والجسيمات subviral (SVPs) هي مقاربة بديلة لتصميم لقاح فيروسي التي توفر مزايا زيادة السلامة الأحيائية والاستقرار على استخدام مسببات الأمراض الحية. غير المعدية وتجميع الذات، وتستخدم VLPs لتقديم البروتينات الهيكلية كما immunogens، تجاوز الحاجة لمسببات الأمراض حية أو ناقلات فيروسية المؤتلف للتسليم المستضد. في هذه المقالة، ونحن لشرح مراحل مختلفة من التصميم فلب والتنمية للتطبيقات المستقبلية في التجارب على الحيوانات قبل السريرية. ويشمل الإجراء المراحل التالية: مجموعة مختارة من مستضد والتعبير عن مستضد في خط الخلية في الاختيار، وتنقية VLPs / SVPs، وتقدير للمستضد الجرعات. ونحن لشرح استخدام كل من خطوط خلايا الثدييات والحشرات للتعبير عن المستضدات لدينا وإظهار كيف تختلف المنهجيات في العائد. قد يتم تطبيق منهجية عرضها على مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ويمكن أن يتحقق عن طريق استبدال مولدات المضادات مع شارع مناعةالبروتينات uctural من الكائنات الحية الدقيقة المستخدم من الفائدة. VLPs وSVPs تساعد مع توصيف مستضد واختيار أفضل المرشحين لقاح.
Introduction
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) هي تكنولوجيا معتمدة للتطعيم البشري. في الواقع، بعض اللقاحات المرخصة أكثر معاصرون، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) وΒ التهاب الكبد (HepΒ) اللقاحات تستخدم هذا النهج. تتشكل VLPs من البروتينات الهيكلية قادرة على التجميع الذاتي. الجسيمات تجميعها تحاكي الأشكال التضاريسية الفيروسية، ولكن لا يمكن أن تصيب أو تكرار لأنها تفتقر إلى الجينوم الفيروسي. VLPs يمكن التعبير عن وتنقيته من عدد من أنظمة بدائية النواة وحقيقية النواة. كشفت مراجعة للأدبيات التي نظم التعبير المختلفة ويعمل على أساس المعدلات التالية: البكتيريا – 28٪، الخميرة – 20٪، والنبات – 9٪، الحشرات – 28٪، والثدييات – 15٪ 1. من المذكرة، ويتم إنتاج لقاحات فيروس الورم الحليمي البشري على أساس L1 البروتين قفيصة في الخميرة (جارداسيل) أو في نظام خلية الحشرات (سيرفاريكس) 2. اللقاحات HepΒ، Recombivax وEngerix-Β، وتنتج أيضا في الخميرة، وتتألف من HepΒ سطح المستضد 3، 4.
نحن نستخدم أنظمة التعبير خلايا الثدييات والحشرات لإنتاج VLPs تتطلب شارك في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة للتجميع. يركز عملنا على تصميم وانتاج، ولقاحات من فلب تنقية ضد مسببات الأمراض البشرية: فيروس الإنفلونزا، الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV)، فيروس حمى الضنك (DENV)، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV). طرقنا مرنة بما يكفي للسماح للمشاركة في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة من البلازميدات التعبير متعددة، أو التعبير البلازميد واحد (الشكل 1). سابقا، وأنتجنا وتنقيته H5N1 VLPs تجميعها من شارك في التعبير عن البلازميدات ترميز هيماغلوتينين الإنفلونزا (HA)، النورامينيداز (NA)، ومصفوفة (M1) في الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية 5،6. الجينات وكودون الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات والمستنسخة في pTR600، ناقل التعبير حقيقية النواة تحتوي على الفيروس المضخم للخلايا فوري أوائل المروج بالإضافة إلى إنترون ألف لبدء transcription من إدراج حقيقية النواة والأبقار هرمون النمو إشارة تذييل بعديد الأدينيلات لإنهاء النسخ 7. تم استخدام نهج مماثل باستخدام ثلاث البلازميد شارك في التعبير عن HA، NA (الشكل 1A) والبروتين مصفوفة الفيروسي بديل، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة P55، لجيل من البشر سلالة الانفلونزا الموسمية H3N2 VLPs في هذه الدراسة، ولقد ثبت لتوليد VLPs مشابهة من حيث الحجم على شكل جسيمات أنفلونزا 8. على الرغم من أن لقاحات الأنفلونزا تثير في الغالب الأجسام المضادة-HA، إضافة نورامينيداز الإنفلونزا تتوسط النشاط سياليداز لتمكين فلب في مهدها من خلايا transfected 9 و أيضا أهدافا مناعة إضافية الحالية. لإنتاج RSV VLPs، اخترنا أيضا جوهر لا علاقة لها من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة لتصميم اللقاحات نموذجية التي تقدم بروتينات سكرية سطح RSV حصرا لمواصلة إبداء المرونة من تشكيل فلب باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة، كما هو موضح سابقا والتي تتميز المجهر الإلكتروني 6،10. آخرونوقد أظهرت في وقت سابق ان VLPs تقديم بروتينات سكرية RSV يمكن تجميعها باستخدام مكونات فيروسية مختلفة من فيروس مرض نيوكاسل (نيوكاسل) 11، ومصفوفة أنفلونزا 12. واستخدمت كامل طول سطح تسلسل بروتين سكري في هذه الدراسة إلى الإبقاء على التشكل الأصلية التي قد تكون ضرورية لمستقبل وظيفي ملزمة والأجسام المضادة الاعتراف الفحص من خلال الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
لدينا أمثلة لاستخدام نظم التعبير البلازميد واحدة لتوليد الجسيمات DENV وCHIKV. في حالة DENV، فإننا يمكن أن تنتج جزيئات subviral (SVPs) مع عدم وجود القفيصة في الخلايا 293T من البلازميد واحد يحتوي على PRM / E الجينات الهيكلي التعبير كاسيت 13. يتم استخدام SVP المصطلح للدلالة على عدم وجود الأساسية أو قفيصة البروتين في تجميع البروتينات الهيكلية الفيروسية. ويمكن أيضا أن تنتج تشيك VLPs استخدام البلازميد واحد يحتوي على CHIKV كاسيت الجين الهيكلي، القفيصة الترميز والمغلف البروتينات، أو في الاولخلايا nsect عن طريق إصابة مع الفيروسة العصوية المؤتلف ترميز نفس كاسيت الجين الهيكلي الأمثل للتعبير عن خلية الحشرات (الشكل 1B – C).
النتيجة النهائية للتعبير النهج التي نوقشت أعلاه هي الافراج عن VLPs إلى مستنبت الخلية التي يمكن بعد ذلك تنقيته عبر تنبيذ فائق من خلال 20٪ وسادة الجلسرين. في هذا التقرير، ونحن نقدم طرق للتعبير عن وتنقية هذه VLPs من أنظمة خلايا الثدييات والحشرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه للتعبير عن بنجاح وتنقية SVPs وVLPs تتكون من البروتينات الهيكلية المتعددة لمختلف مسببات الأمراض. بشكل عام، ونحن نستخدم أنظمة التعبير الثدييات لتوليد VLPs لدينا. ومع ذلك، في أيدينا، المستمدة من الثدييات خلية كانت تشيك عوائد فلب منخفضة. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن ننوه أعضاء مسبق من مختبر روس الذين ساهموا في تحسين بروتوكول للكفاءة القصوى والعوائد.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
