ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.
Abstract
חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) וחלקיקי subviral (SVPs) הם גישה חלופית עיצוב חיסון ויראלי מציע את היתרונות של בטיחות ביולוגית מוגברת יציבות לאורך שימוש פתוגנים חיים. ללא זיהומיות עצמית הרכבה, VLPs משמש להציג חלבונים מבניים כמו immunogens, תוך עקיפת צורך פתוגנים חיים או וקטורים ויראליים רקומביננטי למסירת אנטיגן. במאמר זה, אנחנו מדגימים את השלבים השונים של עיצוב VLP ופיתוח עבור יישומים עתידיים ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. ההליך כולל את השלבים הבאים: בחירה של אנטיגן, ביטוי של אנטיגן בתור תא של בחירה, טיהור VLPs / SVPs, וכימות עבור מינון האנטיגן. אנו מדגימים שימוש בשני שורות תאי יונקי חרקים לביטוי של אנטיגנים שלנו להדגים כיצד מתודולוגיות שונות בתשואה. המתודולוגיה הציג עשויה לחול על מגוון רחב של פתוגנים יכול להיות מושגת על ידי החלפת אנטיגנים עם str immunogenicחלבוני uctural של מיקרואורגניזם המשתמש של עניין. VLPs ו SVPs לסייע באפיון אנטיגן ובחירת המועמדים החיסון הטוב ביותר.
Introduction
חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) מהווים טכנולוגיה אושרה לחיסון אדם. למעשה, חלק מן החיסונים מורשים יותר contemporarily, כולל וירוס הפפילומה האנושי (HPV) Β הפטיטיס (HepΒ) חיסונים להעסיק את הגישה הזו. VLPs נוצר חלבונים מבניים מסוגלים הרכבה עצמית. החלקיקים התאספו לחקות מורפולוגיות ויראלי, אבל לא יכולים להדביק או לשכפל משום שהם חסרי הגנום נגיפי. VLPs יכול לבוא לידי ביטוי מטוהרים מן מספר מערכות פרוקריוטים ו האיקריוטים. סקירה של הספרות עולה כי מערכות ביטוי שונות מועסקות בשיעורים הבאים: החיידקים – 28%, שמרים – 20%, צמח – 9%, חרק – 28%, ו יונקים – 15% 1. ראוי לציין, חיסוני HPV מבוססים על חלבון קפסיד L1 מיוצרים שמרים (Gardasil) או מערכת תא חרק (Cervarix) 2. חיסוני HepΒ, Recombivax ו Engerix-Β, מיוצרים גם בשמרים, והם מורכבים אנטיגן שטח HepΒ 3, 4.
אנו משתמשים במערכות ביטוי תאי יונקים וחרקים לייצר VLPs המחייב שיתוף ביטוי של חלבונים מבניים מרובים להרכבה. העבודה שלנו מתמקדת בעיצוב, ייצור, וחיסונים VLP מבוססי טיהור נגד פתוגנים אנושיים: נגיף שפעת, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), וירוס דנגה (DENV), ו Chikungunya וירוס (CHIKV). השיטות שלנו גמישות מספיק כדי לאפשר שיתוף ביטוי של החלבונים המבניים המרובים פלסמידים ביטוי מרובים, או פלסמיד ביטוי יחיד (איור 1). בעבר, שהפקנו מטוהרים H5N1 VLPs התאספו מן שיתוף ביטוי של פלסמידים קידוד hemagglutinin שפעת (HA), נורמינידאז (NA), מטריצה (M1) בתאים עובריים אנושיים כליות 293T 5,6. הגנים היו קודון אופטימיזציה עבור ביטוי בתאי יונקים ו משובטים לתוך pTR600, וקטור ביטוי איקריוטיים המכיל את ציטומגלווירוס מיידית-מוקדם אמרגן אחד פלוס אינטרון לייזום transcription מוסיף איקריוטיים ואת האות polyadenylation הורמון גדילה שור להפסקת שעתוק 7. גישה דומה באמצעות שלושת פלסמיד שיתוף הביטוי של HA, NA (איור 1 א) ו חלבון מטריקס ויראלי חלופי, HIV Gag P55, שמשה דור VLPs H3N2 תת סוג שפעת עונתית אדם במחקר זה הוכח ליצור VLPs בגודל דומה כחלקיקים שפעת 8. למרות החיסונים לשפעת בעיקר לעורר נוגדנים אנטי-HA, תוספת של נורמינידאז שפעת מתווכת פעילות sialidase לאפשר VLP ניצני מתאי transfected 9 וגם בהווה מטרות immunogenic נוספים. כדי לייצר RSV VLPs, אנחנו גם נבחרנו הליבה הקשורה של HIV Gag לעצב חיסונים אבטיפוס שמציגים גליקופרוטאינים משטח RSV בלעדי להפגין עוד יותר גמישות של היווצרות VLP באמצעות HIV Gag, כפי שתואר לעיל ואופיין על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני 6,10. אחריםבעבר הראו כי VLPs הצגת ניתן להרכיב גליקופרוטאינים RSV באמצעות מרכיבים נגיפיים שונים וירוס מחלת ניוקאסל (NDV) 11, ושפעת מטריקס 12. רצפים גליקופרוטאין משטח באורך מלא נוצלו במחקר זה כדי לשמור על תצורות הילידים כי ייתכן שיהיה צורך עבור קולטן פונקציונלי assay הכרה נוגדן איגוד באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA).
דוגמאות שלנו עבור שימוש במערכות ביטוי פלסמיד בודד כדי ליצור חלקיקים הם DENV ו CHIKV. במקרה של DENV, נוכל לייצר חלקיקים subviral (SVPs) ללא קפסיד בתאים 293T מתוך פלסמיד יחיד המכיל קלטת ביטוי גנים מבניים PRM / E 13. סגן נשיא בכיר המונח משמש כדי לציין את חוסר חלבון הליבה או קפסיד באסיפה של חלבונים מבניים ויראלי. לחי VLPs ניתן לייצר גם באמצעות פלסמיד יחיד המכיל קלטת גנים מבניים CHIKV, קפסיד קידוד חלבוני מעטפה, או אניתאי nsect על ידי הדבקה עם baculovirus רקומביננטי קידוד קלטת הגנים מבני באותו אופטימיזציה עבור ביטוי תא חרקים (1B איור – C).
התוצאה הסופית של ביטוי גישות שנדון לעיל היא השחרור VLPs לתוך מדיום תרבית תאים כי אז יכול להיות מטוהר באמצעות ultracentrifugation באמצעות כרית גליצרול 20%. בדו"ח זה, אנו מציגים שיטות להביע ולטהר VLPs אלה ממערכות תאי יונקים וחרקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השתמשנו הטכניקות המתוארות לעיל להביע בהצלחה ולטהר SVPs ו VLPs מורכבת של חלבונים מבניים מרובים עבור פתוגנים שונים. באופן כללי, אנו משתמשים במערכות ביטוי יונקים ליצור VLPs שלנו. עם זאת, בידינו, תאים יונקים נגזרים תשואות VLP לחי היו נמוכות. תשואת VLP לחי הייתה חזקה יותר בעת השימו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לחברים מראש של מעבדת רוס שעזרו לייעל את הפרוטוקול ליעילות ותשואות מקסימליים.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
