An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Het doel van dit protocol is om moleculaire veranderingen te beschrijven in menselijke diabetische hoornvliezen en laten zien hoe ze kunnen worden ondervangen door adenovirale gentherapie in orgel-gekweekte hoornvliezen. De diabetische corneale ziekte een complicatie van diabetes met frequente afwijkingen hoornvlies zenuwen en epitheliale wondgenezing. We hebben ook gedocumenteerd significant veranderd uitdrukking van een aantal vermeende epitheliale stamcellen markers in menselijke diabetische hoornvliezen. Om deze veranderingen te verlichten, werd adenovirale gentherapie succes uitgevoerd volgens de opregulatie van c-met proto-oncogen expressie en / of neerwaartse regulatie van proteasen matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F. Deze therapie versnelde wondgenezing bij diabetische hoornvliezen zelfs wanneer alleen de limbale stamcel compartiment werd getransduceerd. De beste resultaten werden verkregen met gecombineerde behandeling. Voor mogelijke patiënt transplantatie van stamcellen genormaliseerd, wordt ook een voorbeeld gegeven van de optimizatiop van gen transductie in stamcel-verrijkte culturen met behulp van polykationische enhancers. Deze benadering kan niet alleen nuttig zijn voor de geselecteerde genen maar ook voor de andere mediatoren van corneale epitheliale wondgenezing en stamcel functie.
De diabetische hoornvlies ziekte resulteert voornamelijk in degeneratieve epitheliale (keratopathie) en zenuwen (neuropathie) verandert. Het wordt vaak tot uiting door de afwijkingen van epitheliale wondgenezing en het hoornvlies zenuwen reductie 1-4. Naar schatting 60-70% diabetici hebben verschillende hoornvlies problemen 1,3. Onze studies hebben verschillende merker eiwitten geïdentificeerd met veranderde expressie in humane diabetische cornea waaronder de neerwaartse regulatie van c-met proto-oncogen (hepatocyt groeifactor receptor) en opregulatie van matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F 5, 6. we hebben ook aanzienlijk gedocumenteerd verminderde expressie van verscheidene mogelijke epitheliale stamcel markers in het menselijk hoornvlies diabetes.
In de eerdere studies hebben we een op adenovirale gentherapie om de niveaus van door diabetes veranderde merkers genormaliseerd met menselijke diabetische hoornvlies orgaancultuur, dat langzaam wondgenezing toont ontwikkeld diabetischemarker veranderingen, en stamcel marker expressie verlaging vergelijkbaar met de ex vivo hoornvliezen 7,8. Deze aanhoudende veranderingen blijkt door de aanwezigheid van epigenetische metabole geheugen 9 te zijn. Deze cultuur systeem werd verder gebruikt voor gentherapie. De doelstellingen van deze therapie zijn gekozen markers met hetzij verminderde expressie in diabetische cornea (c-met proto-oncogen), of verhoogde expressie (MMP-10 en cathepsine F).
De adenovirale (AV) therapie werd gebruikt in de hele orgaan- gekweekte cornea of corneoscleral perifere limbale enkel compartiment. Dit compartiment herbergt epitheliale stamcellen die het hoornvliesepitheel te vernieuwen en actief deelnemen aan de wondgenezing 4,10-15. Hier worden protocollen die voor het normaal en diabetische menselijk hoornvlies orgelcultuur, epitheliale wondgenezing, isolatie en karakterisering van stamcellen verrijkt limbale celculturen en adenovirale cel en hoornvlies transductie. Onzeresultaten laten de haalbaarheid van deze therapie voor het normaliseren markerexpressie en wondgenezing bij diabetische cornea voor mogelijke toekomstige transplantatie. Ze suggereren ook dat de combinatietherapie is de meest doeltreffende manier om normale merkerpatroon en epitheliale genezing herstellen bij diabetici cornea 16-18.
De cornea lijkt een ideale weefsel voor gentherapie vanwege zijn oppervlak plaats waar de genafgifte, alsmede de evaluatie van de werkzaamheid en bijwerkingen, zijn eenvoudig. Echter, een klinische vertaling van deze krachtige aanpak is nog steeds traag vanwege de schaarse informatie over de genetische oorzaken van het hoornvlies ziekten en de gentherapie targets 24. Diabetische complicaties met inbegrip van de cornea veranderingen kunnen grotendeels epigenetische in de natuur, wat zich vertaalt in metabole g…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |