Summary
Метод новый метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), быстрое сканирование ЭПР (RS-ЭПР), демонстрируется для 2D спектральной пространственной визуализации , которая превосходит традиционные непрерывного излучения (CW) техники и открывает новые места для визуализации в естественных условиях. Результаты продемонстрированы на частоте 250 МГц, однако данный метод применим при любой частоте.
Abstract
Мы демонстрируют превосходный метод 2D спектрально-пространственной визуализации стабильных радикалов репортерных молекул на частоте 250 МГц с использованием быстрого сканирования электронно-парамагнитного резонанса (RS-ЭПР), который может предоставить количественную информацию в условиях , в естественных условиях от концентрации кислорода, рН, окислительно - восстановительного статус и концентрация сигнальных молекул (то есть, ОН •, • NO). Методика RS-EPR имеет более высокую чувствительность, улучшенную пространственную разрешающую способность (1 мм) и более короткое время сбора данных по сравнению со стандартной непрерывной волны (CW) технике. Разнообразие конфигураций фантомных были протестированы, с пространственным разрешением от 1 до 6 мм, и шириной спектра молекул репортера в пределах от 16 мкТл (160 мг) до 5 мТл (50 г). Перекрестная петля бимодальный резонатор разъединяет возбуждения и обнаружения, снижения шума, в то время как быстрый эффект сканирования позволяет больше мощности для ввода в спиновой системе до насыщения, увеличивая сигнал ЭПР. Этаприводит к значительно более высоким отношением сигнала к шуму, чем в обычных экспериментах CW ЭПР.
Introduction
По сравнению с другими методами медицинской визуализации, электронного парамагнитного резонанса (EPRI) обладает уникальной возможностью количественно изображения физиологические свойства , включая рН 1-3, РО2 4-7, температура 8, перфузии и жизнеспособности тканей 9, микровязкости и легкость диффузии малые молекулы 10 и окислительного стресса 11. Оценка легкости дисульфида расщепления глутатиона (GSH) в тканях и клетках 12,13 могут сообщать о состоянии окислительно - восстановительной. Для визуализации в естественных условиях, ЭПР в диапазоне частот от 250 МГц до 1 ГГц , выбран потому , что эти частоты обеспечивают достаточную глубину проникновения в ткани (до нескольких см) , чтобы генерировать изображения для мелких домашних животных , в которых интенсивности не уменьшалось диэлектрическими эффектами потери. Более высокие частоты, такие как 9,5 ГГц 14 (Х-диапазона) и 17 ГГц (K U -полоее) 15,16 могут быть использованы для получения изображения кожи и волос или отдельных клетокСоответственно. Успех EPRI на всех частотах зависит от парамагнитных спиновых зондов, которые являются специфическими для тканей, так что может быть изображаемых их местонахождение и судьба.
Если среда спина электрона зонда пространственно неоднородны, спектр ЭПР является суммой вкладов от всех мест. Спектрально-пространственная визуализация делит объем образца в массив небольших пространственных сегментов и вычисляет спектр ЭПР для каждого из этих сегментов 17. Это позволяет отображение локальной среды путем измерения пространственных изменений в спектре ЭПР. Магнитные градиенты поля используются для кодирования пространственной информации в спектрах ЭПР, которые называются проекции. Спектрально-пространственное изображение восстанавливается из этих проекций 18,19.
В RS-ЭПР магнитное поле сканируется через резонанс во время, коротка по сравнению с временами релаксации спина электрона (рис 2) 20,21. D econvolution сигнала быстродействующего сканирования дает спектр поглощения, что эквивалентно первому интегралу от обычной первой производной спектра CW. Сигнал быстрого сканирования обнаруживается в квадратуре, так что оба поглощения и дисперсии компоненты реакции спиновой системы измеряются. Это, по существу, сбор в два раза объем данных в единицу времени. Насыщение сигнала в быстром эксперименте развертки происходит при больших мощностях , чем для CW, так что высшие силы могут быть использованы без заботы о насыщении. 20,22 Многие другие средние может быть сделано в единицу времени по сравнению с CW. Более высокая мощность, прямое обнаружение квадратурной и больше в среднем за единицу времени объединяются, чтобы дать быстрое сканирование лучший сигнал-шум (SNR), особенно при высоких проекций градиента, которые определяют пространственное разделение, что приводит к более высоким качеством изображения. Для достижения примерно такой же SNR для изображения фантома требуется примерно в 10 раз до тех пор , как для CW для быстрого сканирования 23.
палатка "> Увеличенный SNR также позволяет эксперименты на частоте 250 МГц с низкой ловушки аддуктов концентрации спинов , образующихся в результате реакции ОН с 5-трет-бутоксикарбонил-5-метил-1-pyrroline- N -оксид (BMPO-ОН) , который будет невидимые для метода CW 24. Dinitroxides , связанные с дисульфидным линкером чувствительны к расщеплению глутатиона, и таким образом может сообщать о состоянии клеточного редокс. Равновесие существует, зависит от концентрации глутатиона настоящее время между ди- и моно-радикальных форм. Соблюдение этих изменений требует захват всего 5 мТл широкого спектра, и может быть достигнуто гораздо быстрее с ЭПР быстрое сканирование по сравнению с степпинг магнитного поля в эксперименте CW.Полная система быстрого сканирования состоит из четырех частей: спектрометр, основное поле магнита, быстрый водитель катушки сканирования, и резонатор кросс-петля быстрое сканирование. Спектрометр и функция главный возбуждающий магнит таким же, как в эксперименте CW, установив основной зеемановскую полеи сбор данных из резонатора. Быстрое сканирование драйвер катушки генерирует ток синусоидальной развертки, который входит в специально разработанных быстрых катушек проверки по резонаторе кросс-петли быстрого сканирования. Быстрые катушки проверки по быстрой развертки резонатора кросс-петлевой генерировать большое однородное магнитное поле, которое будет выброшено на частотах от 3 до 15 кГц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Настройка драйвера Быстрое сканирование катушки на частоте 250 МГц
- Расчет быстрого сканирования экспериментальных условиях
Примечание: Наиболее важным параметром в RS-EPR является скорость сканирования, α, которая является произведением частоты развертки и ширины сканирования (уравнение 3). Для узких ширины сканирования, используются ставки быстрее сканирования, а также для более широких ширины развертки, используются более медленные скорости сканирования. Следующие инструкции пошагово последнем случае и показать, как поступить на экспериментальных параметров драйвера катушки шириной развертки 7 мТл и частотой сканирования 6,8 кГц.- Определите пропускную способность резонатора (BW Res).
(1)
где v Рез рабочая частота резонатора и Q является коэффициент качества. Q = 90, является общим для быстрого резонаторе сканирования, используемых для получения данных в репрезентативных результатов. - Определить быструю скорость сканирования, α, всепричитающиеся с полосой пропускания резонатора
(2) 
где N является константой часто консервативно выбран равным 5-6, ΔB рр является пика до пика производной ширина линии в мТ, и это скорость сканирования , если Т / с для лоренцевом ширины линии.
Примечание: Обычное значение для радикалов в представительском разделе
= 0,1 мТл. По сравнению с более ранней быстрой литературы сканирования; Уравнение 2 определяется путем установки полосы пропускания сигнала (BW Sig) , равную BW Res. - Определить максимальную частоту сканирования быстрый разрешенный скорости.
(3) 
где ш ширина АССп и е частота сканирования. Ширина развертки 7 мТл будет покрывать 100% спектра для текущих зондов , используемых в естественных условиях. Используйте это значение и скорость, рассчитанную в (уравнении 2), чтобы определить частоту сканирования.
- Определите пропускную способность резонатора (BW Res).
- Выбор конденсаторов настройки и настройки быстрого сканирования драйвера катушки
Примечание: быстрый драйвер катушки сканирования, как правило, выполняются в резонировало режиме генерации синусоидальной волны. Резонанс происходит при частоте сканирования, где индуктивные и емкостные сопротивления имеют равные по величине и противоположные знаки, так что общее реактивное сопротивление близко к нулю.- Определить правильную емкость для частоты , определенной в разделе 1.1.3 , используя индуктивность, L, из быстрых катушек сканирования и (уравнение 4).
- Разделить C TOT из (уравнение 4) , в два раза , чтобы получить значения , конденсатор для каждой стороны конденсатора коробки водителя катушки.
Примечание: Быстрое сканирование драйвер катушки имеет два усилителя. При выборе конденсатора, блок конденсатора должен быть уравновешен с равным емкости на каждой стороне коробки. Обе стороны последовательно. - Отвинтить верхнюю крышку конденсатора коробки и вставить конденсаторы с обеих сторон, которые равны значению, определенному на этапе 1.2.2.
- Заменить верхнюю часть коробки конденсатора и закрепите его вниз, чтобы убедиться, что он остается включенным.
- С помощью передней панели водителя резонирует катушки, регулировать выходную частоту до синусоидальный сигнал не имеет максимальную амплитуду.
- Определить правильную емкость для частоты , определенной в разделе 1.1.3 , используя индуктивность, L, из быстрых катушек сканирования и (уравнение 4).
(1) 
(2) 
= 0,1 мТл. По сравнению с более ранней быстрой литературы сканирования; Уравнение 2 определяется путем установки полосы пропускания сигнала (BW Sig) , равную BW Res. 
(3) 
2. Приготовление реагентов и Фантомы
- Получение RadiCALs
- Удалить 15 N-PDT из морозильника и позволить контейнер нагреться до комнатной температуры (10-15 мин).
- Взвесить 1,4 мг 15 N-ФДТ с использованием аналитических весов.
- Добавить 1,4 мг 15 N-PDT до 15 мл деионизованной (ДИ) H 2 O для конечной концентрации 0,5 мМ.
Примечание: 4-оксо-2,2,6,6-тетра (2 H 3) метил-1- (3,3,5,5- 2 Н 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 Н-PDT), 4- 1 Н-3-карбамоил-2,2,5,5-тетра (2 Н 3) метил-3-pyrrolinyloxyl (15 Н-mHCTPO) и 3-карбокси-2,2,5,5-тетра (2 Н 3) метил-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 Н) пирролидинилокси (15 Н-Proxyl) 25 () радикалы Рисунок 1E-G имеют долгосрочную стабильность (2 года) в водном растворе и при комнатной температуре. Их твердые формы, как правило, хранятся в морозильной камере или в холодильнике, чтобы сохранить эти радикалы стабильны в течение многих лет.Стабильность нитроксильных радикалов в целом делает их нетоксичные, и их получение может быть сделано на обычном настольном, когда растворителем является вода. При использовании органических растворителей, готовят растворы нитроксильных внутри вытяжного шкафа во время оснащены надлежащей индивидуальной защиты (СИЗ).
- Получение рН - чувствительного тритил радикалов
- Взвешивают 0,7 мг триарильные метильного радикала (ATAM 4) 26 радикал (1,400 г / моль) и растворяют в 200 мкл абсолютного этанола.
- Взвесить 0.00681 г KH 2 PO 4 (136,1 г / моль) и растворяют в 50 мл дистиллированной воды до конечной концентрации 1 мМ.
- Взвешивают 2,8 г KOH (56 г / моль) и растворяют в 50 мл деионизированной воды для конечной концентрации 1 М.
- Добавить KOH по каплям к фосфатного буфера (2.2.2) для регулирования рН 7,0.
- Добавить 800 мкл 1 мМ фосфатного буфера и 200 мкл ATAM 4 в абсолютном этаноле для окончательного концentration 0,5 мМ в буфере 80:20: этанол.
- Повторите шаги 2.2.1-2.2.5 для создания ATAM 4 образца при рН = 7,2.
- Поместите ATAM 4, рН = 7,0 и ATAM 4, рН = 7,2 в отдельные 6 мм кварцевых пробирок.
- Поместите оба 6 мм кварц EPR трубы в кварцевой ЭПР трубки 16 мм, с толстым Styrofoam распорки 2 мм между ними.
Примечание: Стенки кварцевого образца трубки имеют толщину 0,5 мм, а в дополнение к 2 мм спейсером дают разделение 3 мм между образцами ATAM. Значение рН чувствительные тритиловые радикалы , используемые были синтезированы в Университете штата Огайо 26. Пример , который был использован для получения изображения называется ATAM 4. Реакция , которая учитывает чувствительность рН показана на рисунке 1А.
- Генерация BMPO-OH
- Взвешивают 680 мг KH 2 PO 4 и растворяют в 100 мл дистиллированной воды до конечной концентрации 50 мМ.
- Добавить 1 M KOH по каплямв фосфатном буфере до рН 7,3.
- Взвешивают 50 мг BMPO (199,25 г / моль).
- Смешайте 50 мг BMPO 5 мл фосфатного буфера в кварцевой трубке облучения 16 мм.
- Добавляют 100 мкл 300 мМ перекиси водорода.
- Облучает смесь в кварцевой трубке облучения 16 мм со средним давлением 450 Вт УФ-лампой в течение 5 мин.
- С помощью переноса стеклянной пипеткой, перенесите 2,5 мл облученного раствора BMPO-OH из кварцевого облучения трубки и в одну сторону кварцевую трубку для образца 16 мм с 3 мм делителя.
- Перенесите оставшиеся 2,5 мл облученного BMPO-OH в другую сторону 16 мм кварцевой трубки образца с 3 мм делителя.
- Получение dinitroxide радикала
- Взвешивают 24,7 мг 2 Н, 15 Н-дисульфид dinitroxide (рис 1C) в 1 мл ДМСО в течение исходного раствора 47,5 мМ.
- Готовят 10 мМ трис-буфера, и доведения рН до 7,2.
- Возьмите 40мкл dinitroxide маточного раствора и разбавляют трис-буфером до конечной концентрации 1 мМ.
- Поместите 250 мкл раствора dinitroxide в буфере в кварцевой трубке образца 16 мм с 10 мм делителя в центре.
- Взвешивают 154 мг глутатиона и добавляют к 5 мл буфера Трис для конечной концентрации 100 мМ.
- Добавьте 5 мкл 100 мМ глутатиона раствора до 250 мкл 1 мМ раствора dinitroxide на одной стороне 10 мм делителя для преобразования дирадикалу в монорадикальной.
- Приготовление nitronyl нитроксила
- Удалить радикала из морозильника и позволить контейнер нагреться до комнатной температуры (10-15 мин).
- Взвешивают 1,9 мг nitronyl (390 г / моль).
- Взвешивают 0,56 мг KOH и растворяют в 10 мл дистиллированной воды до конечной концентрации 1 мМ.
- Смешайте 1,9 мг nitronyl в 10 мл 1 мМ раствора КОН для конечной концентрации 0,5 мМ nitronyl.
Примечание: Если necessичных, использовать Вортекс или для повышения скорости ультразвукового сольватации nitronyl.
3. Установка из быстрого сканирования документа на частоте 250 МГц
Примечание: Настройка резонатора с водным образцом нитроксила радикала, который имеет такой же эффект на добротности резонатора и настройки в качестве буферного раствора, является хорошим способом создать для образца, чтобы быть отображены
- Настройтесь резонатор с водным образцом нитроксильного радикала.
- Вставьте 15 мл 0,5 мМ 15 N-PDT в пробе воды в кварцевых ЭПР трубки 16 мм.
- Вставьте кварцевую трубку в сторону обнаружения поперечного контура RS-ЭПР резонатора.
- Изменение частоты источника прибора, пока он не синхронизирует частоту боковой обнаружения, содержащего образец. Ручное изменение несущей частоты источника на 250 МГц, введя нужное значение в программном обеспечении.
- Изменение частоты в сторону возбуждения, чтобы соответствовать frequenстотах источника эксперимента и обнаружения стороны резонатора. Изменение частоты в сторону возбуждения, поворачивая переменный конденсатор внутри резонатора в соответствии с протоколом производителя.
- Настройка приборной консоли и главным магнитом
- Включите спектрометром и выберите эксперимент, который записывает данные для переходных процессов с течением времени по оси абсцисс.
- В программном обеспечении, установите количество точек на 65,536 и временную базу до 10 наносекунд.
- Установить число средних до 10000 для сильного или узкого сигнала, и 45000 для широкого или слабого сигнала.
- Нажмите кнопку "завязать" в программном обеспечении для отправки экспериментальных параметров из программного обеспечения для консоли и активизировать основное поле магнита.
- Установите основное магнитное поле до 9 мТл.
- Установите регулятор ослабления мощности до 50 дБ, и включите усилитель высокой мощности 7 Вт.
4. Исполнениеэксперимента Быстрое сканирование
Примечание: Конкретные инструкции , относящиеся к анализу фантомов , содержащих BMPO-OH 24, рН - чувствительные TAM радикалы 19,27 и окислительно - восстановительные чувствительные dinitroxides 28 представлены в литературе.
- Насыщение мощность стандартного образца нитроксильного
Примечание: Это выгодно, чтобы сделать кривую насыщения мощности на стандартной нитроксильного радикального образца при тех же экспериментальных условиях, которые будут использоваться, чтобы смотреть на радикалов, чувствительных к рН или окислительно-восстановительного статуса.- Включите быстрый драйвер катушки сканирования, со значениями из раздела 1 (частота сканирования 6,8 кГц и ширину сканирования 7 мТл).
- Начиная с 50 дБ, собирать быстрый спектр сканирования с 100k средними. Уменьшение затухания на 3 дБ и повторите измерение. Продолжайте, пока в установке аттенюатора 0 дБ, или до тех пор, пока измерение изоляции на мосту считыванием является <0.
- Перенос тон необработанные данные быстрое сканирование в программу деконволюции (например, написанного в Matlab) и обрабатывать необработанных данных в спектре поглощения.
- Введите частоту сканирования, ширина развертки, количество очков и разверткой в программу, и запустить программу для обработки сырого быстрого сигнала сканирования в сигнал поглощения.
- Plot амплитуду сигнала поглощения в зависимости от квадратного корня мощности (в ваттах), падающего на резонатор. В не-насыщающего режима, амплитуда линейно зависит от квадратного корня из падающей мощности.
- Установить линию тренда, начиная с 0,0 и включают в себя все точки данных, которые попадают в линейной области ответа. В линейной области отклика, амплитуда сигнала возрастает пропорционально квадратному корню из мощности СВЧ.
- Экстраполируйте эту тенденцию к увеличению мощности, и сравнить интенсивность сигнала ЭПР. Используйте самую высокую мощность, для которой амплитуда сигнала не отклоняется более чем на 3% от экстраполируемой линии тренда. В Ордг для деконволюции быстрого сигнала сканирования, чтобы работать должным образом, сигнал должен все еще быть в линейной области ответа относительно падающей мощности.
Примечание: Передача необработанных данных быстрого сканирования может быть сделано через сетевое соединение или с помощью флэш-накопитель. В этом случае передача необходима потому, что программа для обработки исходных данных (Matlab) не находится на том же самом компьютере, который имеет программное обеспечение сбора данных. Алгоритм деконволюции , который обрабатывает необработанные данные описана в 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Продукт эксперимента представляет собой набор проекций, которые реконструируются в двумерную (одна спектральная, один пространственный) изображения с ложной цветовой гаммы для представления амплитуды сигнала. Темно-синий обозначает базовый уровень, где сигнал не присутствует, зеленый низкая амплитуда и красный наиболее высок. Ломтики вдоль оси абсцисс (спектральной размерностью) изображают сигнал ЭПР (ЭПР переход) на оси магнитного поля. Вдоль оси у (пространственное измерение), расстояние между сигналами соответствует физическому пространственному разделению между образцами в резонаторах.
На рисунке 3 показано сравнение двух изображений, полученных с помощью CW (Рисунок 3B) или RS (рис 3а) фантоме с тремя различными типами 15 N замещенных нитроксильных радикалов (рис 3D). Широчайший сигнал соответствует 15 N-Proxyl, пиррол пять членовidine кольцо с отрицательным зарядом при физиологическом рН, что может помочь целевой молекулы в специфических клеточных отсеков. Сигнал дублет принадлежит 15 N-mHCTPO и является результатом одного водорода в противном случае посреди полного дейтерировании. Это единственное расщепление было оптимизировано для мониторинга изменений в концентрации кислорода 30. Узкая сигнал поступает из 15 N-PDT, гибкий пиперидиновое кольцо, которое полностью дейтерированного. Он может быть использован для контроля концентрации кислорода, или окислительно-восстановительной среды (снижение структуры приводит к уменьшению сигнала ЭПР).
В то же время приобретения 5-мин, изображение RS показывает превосходное пространственное разрешение и четкость спектрального рисунка для каждого радикала. Одной из причин для улучшения RS над CW можно видеть путем сравнения спектров при двух различных сильных градиента между этими двумя методами (рис 3C). По мере увеличения силы градиентаспектральный сигнал расширяется. Значительное ухудшение спектра CW при высоких градиентов (1 мТл / см), которые кодируют пространственную информацию.
Поскольку производная сигнала расширяется быстрее, чем сигнал поглощения, ОСШ для самого высокого градиента CW проекции (красная линия) очень бедна по сравнению с самой высокой проекции градиента RS (синий след). Ширина линии в зависимости от пространственного положения может быть извлечена из 2D-участка. Ширина линии будет широкая или узкая на основе изменений в концентрации кислорода или вязкости вокруг нитроксильного зонда. Фантом изображается на фигуре 3А был при комнатной температуре и открытым для воздуха. Поскольку содержание кислорода и вязкость (как определяется температурой) оставались стабильными, ширина линии каждого зонда должна быть постоянной по всей ширине каждой трубки , содержащей радикал. На рисунке 4 показан разброс в ширин подходят от срезов через 2D - изображения по сравнениюк истинному значению ширины линии (черная горизонтальная линия). Значения срезов изображения, особенно для 15 N-ФДТ, являются лучше подходит к истинному значению ширины линии для RS (рис 4A) , чем для CW (фиг.4В). Это также является результатом улучшения SNR РС над техникой CW.
Еще одно преимущество метода RS является способность генерировать широкие магнитные однородное поле появляется на экране в течение очень короткого времени. Типичная частота сканирования для экспериментов на частоте 250 МГц составляет 9 кГц, что соответствует 0,11 мс. Это 0,11 мсек поле развертки, является ли 0,5 мт или 5,0 мТл. Сравните это с CW, где 5,0 мТл развертка займет десятки секунд до нескольких минут. При быстром сканировании становится возможным быстро собрать 100% спектральной информации в периоды , которые поддаются визуализации в естественных условиях.
На рисунке 5 демонстрируют широкий спектр ЭПР RS-яmaging применяется плести улавливающий моделей. Важные сигнальные молекулы, такие как ОН • и NO • являются эндогенными свободные радикалы с очень короткими временами жизни. Для изучения этих молекул, используются "спиновых ловушек". Примером реакции спиновой ловушки 31 (BMPO) ОН • показан на фигуре 1В. Визуализация фантома , содержащего 5 мкМ BMPO-OH - аддукт показано на рисунке 5 (A, B). Сигнал аддукт спин-ловушки зависит от исходной концентрации ОН • и имеет период полураспада 30 минут , позволяющих изучать любые процессы , которые генерируют ОН •. Nitronyl nitoxide 32 был использован в качестве другого примера широкого спектра изображений, но был использован в прошлом для выделения улавливание NO • 33,34. Визуализация фантом , содержащий nitronyl показано на рисунке 5 (C, D). Для зрв ловушках, захватывая весь спектр позволяет лучше обозначение исходного переходного радикальных частиц, которые присутствовали.
Чувствительность к физиологическим изменениям , как рН и окислительно - восстановительного состояния происходит от изменений всего спектра. На рисунке 6 показан изображений с Atam 4. На рисунке 6B, профиль ATAM 4 при рН = 7,0 (синий) имеет множество спектральных особенностей, и кусочек с изображения хорошо совпадает с соответствующим нулевым градиентом спектра (зеленый). Сравните это с профилем ATAM 4 при рН = 7,4, фиг.6С, с меньшим количеством спектральных признаков и до сих пор в хорошем согласии с соответствующим нулевым градиентом спектра. Получение изображений фантомов , содержащих от dinitroxide в его димерных и уменьшенный мономерной формы показаны на рисунке 7. Два различных спектров генерируются путем расщепления дисульфида (SS), и таким образом передают чувствительность к редокс ENVironment 1,35.
Рисунок 1. ЭПР - зонды чувствительны ко многим физиологическим изменениям. (А) Пример из рН-чувствительных три-арил-метил (TAM) радикалов 26. (B) Спинозахватывающее BMPO. (С) 15 Н-dinitroxide. (D) nitronyl. (Е) 15 Н-Proxyl. (F) , 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Быстрое сканирование ЭПР имеет по своей природе лучше SNR. (A) Iп CW ЭПР амплитуда ч составляет малую долю от общего сигнала, определяется модуляцией магнитного поля. (В) в режиме прямого обнаружено быстрое сканирование, обнаруживается амплитуда полного сигнала. Сигнал к увеличению шума проявляется в эксперименте , в котором супероксид , порожденного Е. фекальный в ловушке с BMPO в Х-диапазоне частот. В то же время приобретения 30 сек, вряд ли какой - либо сигнал наблюдается в спектре CW (C) в то время как сильный сигнал наблюдается в быстром спектре сканирования (D) 36. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Улучшение SNR позволяет улучшить пространственное разрешение. По той же 5 минут времени захвата, изображение RS (
Рисунок 4. Информационное содержание быстрого сканирования изображения выше , чем для CW. (A) Кусочки изображения 2D RS. (B) Кусочки изображения 2D CW. Истинная ширина линии (черная горизонтальная линия) каждого образца показана для сравнения. См ссылку 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Быстрое поле подметание позволяет захватывать целого спектра в течение нескольких секунд. (A) 2D спектрально-пространственное изображение фантома , состоящего из BMPO-OH аддукта. (Б) Моделирование прилегают к безградиентной спектра BMPO-OH на частоте 250 МГц был использован , чтобы соответствовать первоначальной BMPO-OH изображения и различия между регионами , содержащими BMPO-OH и шума , содержащий областей. (С) 14 Н nitronyl радикал , который может быть использован для улавливания оксида азота в естественных условиях. (D) рассекает каждого спектра показать форму спектра на частоте 250 МГц. См ссылку 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Никакая часть спектра отсутствует, что позволяет лучше контролировать физиологически индуцированных спектральных изменений. (A) 2D спектрально-пространственное изображение фантома , состоящего из двух трубок рН чувствительной ATAM 4 радикала. (B) Спектральный профиль ATAM 4 при рН = 7,0 (синий) и соответствующий нулевой градиент спектра (зеленый). (С) Спектральный профиль ATAM 4 при рН = 7,4 B (синий) и соответствующий нулевой градиент спектра (зеленый). Ссылки см 19,26,37. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Быстрое сканирование открывает дверь в естественных условиях мониторинга окислительно - восстановительной в на частоте 250 МГц. (A) 2D спектрально-пространственного изображения 15 N-dinitroxide. (B) рассекает сверху (синяя линия) и нижней (красный след) отсеков , расположенных в двух изображениях. (C) Верхний отсек остается тем же самым , но нижний отсек был уменьшен с глутатиона. (D) показан срез каждого объекта изображения , показывающий изменение в спектре 1D нижнего отсека. См ссылки 1,28,35. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сигналы Rapid-сканирования имеют более высокие частотные составляющие, чем CW, и требуют большей пропускной способности резонатора в зависимости от ширин, времен релаксации, а также скорость быстрых-сканов. Полоса пропускания, необходимая для данного эксперимента основан на ширину линии и скорости сканирования магнитного поля (уравнение 2). В зависимости от времени релаксации зонда при исследовании (Т 2 и Т 2 *), а скорость сканирования, колебания могут появиться на задней кромке сигнала. Для нитроксильных радикалов с T 2 ~ 500 нс на частоте 250 МГц (57 - й Скалистых гор конференции по магнитному резонансу, Epel, B, и др., 2015), экспериментальные скорости сканирования часто недостаточно высоки для наблюдения каких - либо колебаний.
Экспериментальная ширина полосы, как правило, ограничена пропускной способностью резонатора. Каждая половина цикл быстрой эксперимента сканирования записывается либо с уменьшением или увеличением поля / частоты, поэтому экспериментальная полоса пропускания ½ тон резонатору полосу пропускания, как показано в формуле (уравнение 1). Если экспериментальная ширина полосы частот ограничена выбором параметров таким образом, что она больше, чем полоса пропускания резонатора и колебания затухают, уширение результаты в деконволюции линии. Поскольку пропускная способность эксперимента определяется скоростью и шириной линии радикала изучается, понимание этих особенностей является ключевым компонентом быстрого эксперимента сканирования.
Текущий протокол демонстрирует EPRI на частоте 250 МГц фантомов , содержащих зонды , чувствительные к кислороду, вязкости, рН, эндогенные переходных сигнальных молекул (то есть, ОН •, • NO) и окислительно - восстановительного статуса. Пространственным разрешением от 1 до 3 мм были продемонстрированы, с экспериментальными время обнаружения между 29 секунд (одной линии 2 линии 15 N спектра A, рисунок 3) и 15 минут (полный спектр 5 мкМ BMPO-OH, рисунок 5). Разработка методики с фантомами шоуиспользование RS-EPR изображений заменяет обычную CW-ЭПР метод визуализации 23,24, и открывает новые возможности для визуализации в естественных условиях с использованием ЭПР зондов.
НИИЭ выгодно по сравнению с другими методами в естественных изображений , основанных на флуоресценции или фосфоресценции, ЭПР - зонды чувствительны к более широким разнообразием явлений в естественных условиях. Кроме того, проникновение ВЧ на частоте 250 МГц составляет ~ 7 см, так что аномальная ткань на более глубоком уровне могут быть изучены. Ядерный магнитно-резонансная томография (МРТ) обеспечивает очень подробные анатомические карты, но изо всех сил пытается дать количественную информацию физиологической. Сочетание МРТ и EPRI однажды может привести к магнитно-резонансной все версии позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) / компьютерной томографии (КТ) сканера. Такой инструмент обеспечит те же преимущества ПЭТ / КТ, но без тяжелых доз радиации или дорогих радио-трассеров.
Разработка методики с фантомами продолжает толкать тон ограничивает РС-EPR, но конечная цель состоит в том, чтобы реализовать методику в лабораториях с использованием животных моделей. Расчеты для реконструкций изображений должны быть улучшены, чтобы ускорить сбор данных для 4D эксперимента (3 пространственном, 1 спектральное измерение). Улучшенный алгоритм в настоящее время разрабатывается и имеет важное значение для применения в естественных условиях, однако доказательство принципа может быть сделано с 2D - визуализации.
Многие из радикалов, таких , как 15 N-PDT, используемых в фантомах быстро деградируют в условиях , в естественных условиях с периодом полураспада всего 60 секунд. Радикалы с улучшенной устойчивостью к сокращению 39 в естественных условиях, были синтезированы и имеют важное значение для создания достаточно больших концентраций в естественных условиях. Повышенная чувствительность RS-ЭПР над CW-ЭПР 24 будет еще одно преимущество в решении этой проблемы. Чувствительность быстрого сканирования в настоящее время 5 мкМ для фантома, и от 100 мкм до 5 мм, в зависимости отзонд в образ, для исследований на животных, проводимым в Университете Чикаго (личное сообщение, Маджо, М., 2015). Метод RS будет продолжать развиваться , чтобы закрыть этот пробел, но приложение уже начал двигаться в фактическое в естественных условиях применения (57 - й Скалистых гор конференция по магнитному резонансу, Epel, B, и др., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Частичная поддержка этой работы NIH предоставляет NIBIB EB002807 и CA177744 (GRE и SSE) и P41 EB002034 к GRE, Howard J. Гальперном, PI и Университетом Денвере с благодарностью. Марк Цейтлин был поддержан NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Авторы благодарны Валерию Храмцов, в настоящее время в Университете Западной Вирджинии, и Illirian Dhimitruka в Университете штата Огайо для синтеза рН чувствительных радикалов ТАМ, и Джеральд Розен и Джозеф Као в Университете штата Мэриленд для синтеза mHCTPO , proxyl, BMPO и nitronyl радикалы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) | CDN Isotopes | M-2327 | 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada |
| 4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29 |
| 3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25 |
| 4 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | 707-SQ-100M | |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) | CDN Isotopes | D-2328 | 98% atom D, Quebec Canada |
| pH sensitive trityl radical (aTAM4) | Ohio State University | N/A | Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26 |
| Potassum Phosphate, Monobasic | J.T. Baker Chemicals | 1-3246 | |
| 6 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-5M-6M-0-250/RB | |
| 8 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-7M-8M-0-250/RB | |
| 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30 |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 SIGMA | 30% |
| 16 mm Quartz EPR tube | Wilmad Glass | 16-7PP-11QTZ | |
| Medium Pressure 450 W UV lamp | Hanovia | 679-A36 | Fairfield, NJ |
| L-Glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G470-5 | |
| Nitronyl | NA | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31 |
| Sodium Hydroxide | J.T. Baker Chemicals | 1-3146 |
References
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
- Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I.
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
- Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
- Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
- Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
- Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
- Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
- Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
- Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
- Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
- Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
- Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
- Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
- Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
- Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
- Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
- Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
- Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
- Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
- Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
- Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
- Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
- Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
- Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
- Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
- Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
- Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).
