Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.
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Artigo de método
Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed - usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos - alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.
Introdução
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos tê....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo.
1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice
NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandibulares de ratinhos segue um protocolo estabelecido com modificações menores 23.
- O isolamento de glóbulos brancos do sangue t....
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Resultados
Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas 26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propagação de células mieló.......
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Discussão
O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microscopia confocal .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.
Agradecimentos
Os autores não têm agradecimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Heparina | sódica APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK tampão de lise | Lonza | 10-548E | |
| Soro bovino fetal | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolissacarídeos | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Cloridrato de cetamina | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xilazina | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazina | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Creme depilatório | Church & Dwight | ||
| Acetona | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolona | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anticorpo anti-camundongo Ly6G | BioLegend | 127610 | |
| Seringa de insulina U-100 com agulha 28 G | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Conjunto de infusão de borboleta (agulha 27 G) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur citômetro | BD | ||
| CellQuest Software | BD | ||
| Olympus | FV1000 | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Referências
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E.....
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Reimpressões e permissões
