Summary

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Published: June 22, 2016
doi:

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l'existence et l' importance de neutrophiles amorçage lors de l' infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed – utilisé comme une mesure d'amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles – réalisé par injection de l' antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l'imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l'oxazolone-cutanée de l'oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l'imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d'imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l'isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l'état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l'examen d'autres cellules immunitaires dans les modèles d'inflammation de la souris.

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d'infection ou d'une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d'oxygène et d' azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases 1 antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont "apprêtées" par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d'inflammation 2. Les mécanismes d'amorçage de neutrophiles ont été étudiés in vitro 3,4; Toutefois, le suivi dynamique du processus in vivo n'a pas été possible à ce jour.

Récemment, l'imagerie intravitale est devenue une technique importante pour la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire des processus biologiques dans les organismes vivants. Intraviimagerie tal peut être réalisée par excitation au microscope un photon classique (par exemple, confocale) ou des approches microscopie multiphotonique 5. Au fil du temps, des améliorations substantielles ont été réalisées dans cette technique permettant une meilleure résolution d'image, l' amélioration de la profondeur d'imagerie, une diminution de photovieillissement de tissu, et le renforcement de 6,7 de stabilisation d'image. Compte tenu de sa capacité unique de permettre une visualisation dynamique de la migration cellulaire et l' interaction au fil du temps, la microscopie intravitale a été largement appliquée à divers domaines d'études en immunologie 8. imagerie intravitale permet immunologistes de mieux comprendre et contextualiser les réponses immunitaires à la fois au niveau cellulaire et moléculaire dans la vie des modèles animaux.

Des progrès récents dans transgéniques ainsi que des souris knock-in rapporteuses ont fourni des outils utiles pour la surveillance des comportements dynamiques des neutrophiles chez les animaux vivants. Lysozyme M promoteur-driven améliorée protéine fluorescente verte knock-inles souris ont été largement utilisés pour caractériser la motilité des neutrophiles, des monocytes et des macrophages au cours de divers processus inflammatoires comprenant une extravasation, une infection bactérienne, une inflammation stérile et 9-15. En outre, des souris transgéniques exprimant une résonance de fluorescence cytoplasmique de transfert d'énergie biocapteur ont été utilisés dans l' étude de l'activité des neutrophiles mitogene kinase extracellulaire régulée et la protéine kinase A l' intérieur de l' intestin enflammées 16. Un modèle de souris avec une spécificité élevée pour l' expression de la fluorescence dans des neutrophiles est la souris knock-in Catchup, qui produit la recombinase Cre, ainsi que la tdTomato protéine fluorescente, qui est lui – même couplé à l' expression de l' antigène des lymphocytes 6G (Ly6G) 17. Visualisation des neutrophiles Ly6G déficientes par ce modèle a montré que ces cellules exercent une fonctionnalité normale dans une variété de contextes in vivo inflammatoires stériles ou infectieuses. Des souris transgéniques exprimant la DsRed fluorescente protein gène sous le contrôle de la souris interleuikin-1β (IL-1β), le promoteur (pIL1-DsRed) ont été utilisés pour visualiser les comportements motiles de cellules produisant de l'IL-1 ß – censé inclure les neutrophiles, les monocytes inflammatoires et des macrophages activés – émergents dans la peau enflammée 18.

In vivo l' étiquetage peut servir comme une approche alternative pour tracer les comportements cellulaires et moléculaires de neutrophiles dans les tissus enflammés. Après injection intraveineuse de faibles doses de fluorescence anticorps anti Gr-1-anticorps monoclonal (mAb), la cascade de recrutement de Gr-1 + neutrophiles a été visualisées dans des lésions de la peau de souris infectées par Staphylococcus aureus 19. L' administration in vivo des conjugués contenant de la streptavidine conjugués 705 points quantiques nm et biotinylé anti-Ly6G mAb étiqueter spécifiquement neutrophiles circulants 20. En outre, l'endocytose de ces conjugués dans neutrophvésicules IL permet le suivi du transport vésiculaire à grande vitesse dans les neutrophiles qui migrent dans le tissu interstitiel. In vivo , le marquage avec des anticorps fluorescents conjugués contre la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL-1), L-sélectine (CD62L), l' intégrine aM (CD11b ) et chimiokines (CXC motif) récepteur 2 (CXCR2) dans un modèle inflammatoire induite par le TNFa a élucidé les mécanismes de régulation en jeu lors de l' inflammation précoce 21. polarisants neutrophiles font saillie uropodes PSGL-1-enrichi à interagir avec CD62L présent sur les plaquettes activées, ce qui entraîne une redistribution des CD11b et CXCR2, des récepteurs qui stimulent la migration des neutrophiles et déclenchent l'inflammation.

IL-1β est l' un des gènes de signature qui est élevée dans les 22 neutrophiles amorcées. Chez les souris rapporteurs pIL1-DsRed, des signaux de fluorescence DsRed (ie., L' activation du promoteur IL-1β) une corrélation positive avec l' IL-1β expression de l' ARNm et de la production de la protéine IL-1β. <sup> 18 Pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage, une méthode de microscopie intravitale a été développé impliquant l' induction de l' inflammation de la peau avec oxazolone (OX) dans le modèle de la souris pIL1-DsRed après marquage in vivo des neutrophiles avec fluorescence conjugué anti-Ly6G mAb. À travers ce modèle, il est possible d'étudier le comportement et la fonction des neutrophiles amorcées dans des modèles animaux de diverses maladies et affections.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les instituts nationaux de directives de santé et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Toledo. 1. phénotypage de pIL1-DsRed Souris NOTE: Offspring sont générés par l'élevage des souris pIL1-DsRed hétérozygotes souris de type sauvage (WT) C57BL6. Trois à quatre semaines vieux chiots sont considérés comme p…

Representative Results

Criblage des souris pIL1-DsRed est effectuée sur la base du signal de fluorescence de DsRed phénotypiques produite par les leucocytes du sang périphérique en utilisant la cytométrie de flux. Stimulation par le LPS est connu pour induire la production d' IL-1β dans les cellules myéloïdes , y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques 26-28. Ainsi, les leucocytes isolés sont incubés avec LPS pendant 4 heures avant de cytométrie en flux an…

Discussion

Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n'a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l' induction d' une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l' amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

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Citar este artigo
Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

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