Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

Dorrelyn P. Martin; Jharna Miya; Julie W. Reeser; Sameek Roychowdhury

doi:10.3791/54090

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Artigo de método

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

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DOI:

10.3791/54090

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4 de agosto de 2016

Dorrelyn P. Martin¹ , Jharna Miya¹ , Julie W. Reeser¹ , Sameek Roychowdhury¹^,²

¹Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, ²Department of Pharmacology, The Ohio State University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.

Resumo

sequenciação de ARN (RNA-Seq) é um método versátil que pode ser utilizado para detectar e caracterizar a expressão do gene, mutações, fusões de genes, e RNAs não codificantes. Padrão RNA-Seq requer 30-100.000.000 sequenciamento lê e pode incluir vários produtos de RNA, tais como mRNA e RNAs não codificantes. Demonstramos como alvejado RNA-Seq (captura) permite um estudo focado em produtos de RNA selecionados usando um sequenciador de desktop. captura de RNA-Seq pode caracterizar transcrições não anotadas, baixa ou transitoriamente expressas que podem de outra forma ser atendidas através de métodos RNA-Seq tradicionais. Aqui nós descrevemos a extração de RNA a partir de linhas celulares, depleção de RNA ribossomal, síntese de cDNA, a preparação de bibliotecas de código de barras, hibridação e captura de transcritos alvo e sequenciamento multiplex num sequenciador desktop. Nós também destacar o pipeline de análise computacional, que inclui a avaliação de controle de qualidade, o alinhamento, a detecção de fusão, a quantificação expressão genética e identificação de único nucvariantes leotide. Este ensaio permite a sequenciação transcrição direccionada para caracterizar a expressão do gene, fusões de genes e mutações.

Introdução

O transcriptoma completo ou sequenciamento de RNA (RNAseq) é um método de sequenciamento imparcial para avaliar todos os produtos de RNA. O objetivo do RNAseq direcionado (captura) é uma avaliação focada de transcritos selecionados com maior sensibilidade, faixa dinâmica, custo ou escala reduzida e maior rendimento em comparação com o RNAseq padrão. Semelhante ao RNAseq padrão, abordagens de enriquecimento direcionadas podem ser usadas para avaliar a expressão gênica, várias espécies de RNA, como mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA¹, outros RNAs não codificantes², fusões gênicas³ e mutações^4-6.

A captu....