Summary
人多能干细胞（hPSCs）具有分化和自我组织成不同的组织型态的内在能力;尽管这需要空间环境梯度的表现。我们提出模版图案化作为一种简单而可靠的方法，以产生生物化学和机械梯度用于控制HPSC分化模式。
Introduction
人多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（胚胎干细胞）和诱导多能干细胞（人iPS细胞），被广泛利用于再生医学以及正常和病变器官的实验模型，因为它们的分化潜能的进入所有的细胞谱系三种胚层1,2。 hPSCs分化命运是可以调节通过物理线索3-5介导的自分泌或旁分泌信号1以及机械传导过程当地的环境因素非常敏感。细胞微图案包括一组已发展到在空间上组织的细胞群的几何形状和位置作为平均值来控制本地细胞微环境，如细 胞-细胞相互作用6和细胞-基质相互作用3的技术。在hPSCs的背景下，细胞微已被用来获得显著的认识到如何利基依赖耳鼻喉科自分泌信号调节胚胎干细胞多能性分化的第7和组织成早期胚胎分化的模式6。二维和三维微图案hPSCs已被用来控制多细胞型态，这反过来又影响分化决定成三种胚层8,9的菌落尺寸。我们采用多HPSC微图案来调制HPSC菌落内的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的程度来探测整联E-钙粘蛋白的串扰可以如何产生细胞命运异质10。从朝hPSCs作为实验模型用于发育疾病11，要研究的组织或器官发育过程中的生长因子和激素的影响药毒性筛选的多细胞微图案的应用上述报告打开新的途径的示范，并解开的形成组织模式。
细胞micropatter有无数宁技术已被开发作为由Falconnet 等审查。人 12，但只有一小部分，如微接触印刷7,8,13，微孔文化14,15，光图案6和microstencils 16已成功地实施hPSCs。与缩微hPSCs的挑战在于他们的脆弱性和具体的细胞外基质（ECM）和生长条件的细胞附着和生存的严格的要求。对于2D HPSC模式，微接触印刷是最常用的方法，以产生对组织培养和玻璃基板13 HPSC微图案之一。该方法可用于在HPSC培养，包括层粘连蛋白和基底膜基质，如基质胶中使用图案共同的ECM。然而，它通常需要用聚-D-赖氨酸辅助的两步涂层的方法，并且需要特定的惰性大气和湿度条件下，使稳定的ECM微图案为hPSCs到6,13- 附加。每个图案化方法的首要考虑因素是表面修饰制度是否能够产生在所需的几何分辨率HPSC粘性ECM模式，同时尽量减少非特异性的细胞附着到周边地区。
在这里，我们报告的模板使用缩微作为一种简单的方法来产生HPSC微图案无粘结ECM模式产生之前的其他表面改性步骤hPSCs附加上。小区模版包括薄膜， 例如，聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材，具有微米到毫米的通孔密封到一个细胞培养基材的物理上包含ECM的涂料，并随后接种hPSCs大小。作为模版图案形成工程通过物理约束，其中HPSC可以访问和连接直接到下面的ECM涂覆的衬底的位置，该方法是与能够支持HPSC培养各种基材相容。唯一requirement是该模版材料的选择可以形成与基材的可逆密封。这些底物包括常规组织培养聚苯乙烯（TCPS）17，配体缀合的基片18，以及与可调刚性的弹性体基底（ 例如 ，PDMS）19。这种方法还允许不同的ECM的涂层，例如玻连蛋白（或VTN蛋白），层粘连蛋白和基底膜基质（ 例如 ，基质胶和Geltrax），以允许适当附着和hPSCs的分化。为特定HPSC线。因此，我们可以传送优化的ECM-基板配置到模版图案化以获得最佳的细胞 - 基质粘附，存活和分化。最近，一个类似的方法也有报道直接通过使用聚甲基丙烯酸甲酯微图案的hESCs（PMMA）微模版阵列16肝分化。
细胞的模板可以由不同的材料制成，包括满足ALS 20,21，聚（对苯二甲基）聚合物22,23，聚甲基丙烯酸甲酯16和最常见的是，PDMS 24-28。硅和聚（对-亚二甲苯）聚合物模具需要具有专门的设备20-23，这限制了它们的可访问生物用户通孔的直接蚀刻。 PDMS模具可以通过根据所需的特征尺寸，其通常从3微米至2,000微米11,26-29范围不同的方法来制造。如果小的功能需要，薄板材制版可通过冲压成型PDMS在包含微图案28的浮雕精细加工硅模板预聚物生产。为特征> 1000微米，CO 2激光切割器提供了一种简单和低成本的方法模版制造期间直接切上的预铸的PDMS片的图案。 PDMS模具的可回收也使得它们具有成本效益的，进行了一系列的具有足够一致性的实验。
10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
备注：本协议描述PDMS模具的制造与1000微米的图案通过激光切割和图案化的人类胚胎干细胞系，H9使用PDMS模板。
1.设计和微图案PDMS模板的制作
- 设计具有所需的几何形状和尺寸（ 例如 ，1000微米圈）和使用计算机辅助设计软件10模版垫片的贯通孔的制版薄板。
- 激光切割的120-150微米和2毫米厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片分别使用CO 2激光切割器10的制版薄板和垫片。
- 粘结的PDMS垫片用液体未固化的PDMS和烘烤的PDMS蜡纸在60℃下3-4小时，以获得用于微图案的PDMS模具。
- 消毒通过高压与PDMS模版，在120℃下，在使用前的烘箱30分钟并干燥。
2.人类胚胎干细胞主tenance
- 培养的hESC细胞系在无饲养维持培养基上1×的hESC合格基底膜基质涂覆的细胞培养板在37℃和5％的CO 2。
- 通道的时候都大致由3分钟温育70％汇合，在37℃用分散酶处理和机械解离胚胎干细胞集落入100-200微米的团块的人类胚胎干细胞。 6分光比：30-50团块每生长面积9.6 平方厘米的基底膜基质涂层组织培养聚苯乙烯在1密度板材的人类胚胎干细胞团块。
3.人类胚胎干细胞的模具微图案
- 准备细胞图案前
- 通过分配在超纯水700μl的70％的分析纯的乙醇放入培养皿，并把模版上顶部密封一个PDMS模版到60毫米的培养皿。
- 将生物安全柜内培养皿一夜之间令t他乙醇干燥。
- 检查模板下方存在无气泡，保证了模具形成具有培养皿良好的密封。这可以防止的ECM涂覆溶液泄漏。密封在无菌条件下在培养皿和存储直到它准备好细胞接种。
- 据分析证书准备的hESC合格基底膜基质的等分。确保每个等分试样产率1×的hESC合格基底膜基质溶液在25ml的Dulbecco改良Eagle培养基中稀释时：营养混合物F-12（DMEM / F12），根据制造商的产品片。
- 通过加入的hESC合格基底膜基质的一种分装成16.7毫升的DMEM / F12，以使1.5×的hESC合格基底膜基质溶液制备的ECM涂覆溶液。保持冰的所有ECM涂层解决方案，以防止凝胶化。
- 人类胚胎干细胞的补充维持培养基用10μMROCK抑制剂（Y27632）。
- 对待培养皿100 WO 2等离子90秒。以确保无菌性，只打开等离子体处理之前的等离子体室内部的培养皿盖，并迅速覆盖背面治疗结束后的培养皿。这有利于表面润湿，并防止另外的ECM涂布溶液过程中的通孔的微图案形成气泡。
- 添加450微升的1.5×的hESC合格基底膜基质溶液覆盖整个模具。密封培养皿具有自密封膜，如石蜡膜，以防止该溶液干涸，并在使用前于37℃孵育5小时。
- 人类胚胎干细胞播种到钢印基板
- 检查在6孔板的hESC集落，以确定表示典型的hESC形态损失的分化的细胞区域（ 例如，圆形的，紧密PACKE的损失ð上皮形态，高核/质比核仁明显）。除去使用真空吸气器有区别的区域。
- 以每孔2mL的DMEM / F12洗涤两次。
- 加入1 ml消化酶，诸如的Accutase的，每6孔板的孔中并在37℃孵育8分钟。轻轻敲击板从基材分离所有殖民地。
- 与至少4毫升每毫升消化酶的DMEM / F12的冲洗每个孔，并收集细胞悬液分成15毫升锥形管中。
- 离心在200×g下将细胞悬浮液在室温下3分钟。
- 抽吸除去上清，加入400微升补充有ROCK抑制剂（ROCKi）hESC细胞维持培养基来重新悬浮细胞。吸取细胞悬液上下轻轻3次打破团块成单个细胞。
- 混合单细胞悬液好，稀释10微升细胞样本为190微升DMEM / F12（1:20稀释）的。使用hemocytome之三，以确定在股票细胞悬浮液的细胞密度。
- 计算对于给定的模版所需的细胞接种密度。
注意：例如，我们已通过实验确定的细胞接种密度，以获得单细胞的汇合单层是约4,444个/ mm 2。因此，随着为450mm 2的面积和400微升的接种体积模版将需要一个细胞悬浮液以200万个细胞/ 400微升的密度。 - 稀释股票细胞悬液到所需的接种密度（见步骤3.3.8注）补充了人类胚胎干细胞ROCKi培养基。
- 添加包含所需数量的细胞到每个模版细胞悬浮液的指定体积和离开的培养皿在室温下在通风橱中不受干扰5分钟以使细胞沉淀。
- 转移培养皿进入培养箱，孵育1小时，以允许细胞附着。请注意在保持培养皿水平转移过程中，使细胞保持在模板单层。
- 模板拆除和无图案基板的钝化
- 在显微镜下检查培养皿，以检查是否细胞被适当地附着在下面的衬底。
- 从模具吸走细胞悬液。
- 加的在DMEM / F12 0.5％细胞培养物相容的非离子表面活性剂为2ml /皿周围模版的区域。
- 使用一对蒸压镊子轻轻撕下模板。漩涡非离子表面活性剂溶液周围的模版被剥离，以防止细胞干燥。目视观察微图案化细胞在培养皿。
- 孵育微图案化细胞在0.5％的非离子表面活性剂的DMEM / F12溶液在37℃10分钟。
- 抽吸掉非离子表面活性剂的DMEM / F12溶液。用2ml / DMEM / F12的碟洗3次。
- 人类胚胎干细胞加入2毫升/皿维持培养基补充有ROCKi并在37℃下孵育过夜。
- 过夜孵育后，补充有ROCKi抽吸人类胚胎干细胞维持培养基，用DMEM / F12洗涤一次，并加入2毫升/分化培养基的培养皿补充有100纳克/毫升活化素，25纳克/毫升BMP4和10ng / ml的FGF2诱导mesoendoderm分化。
- 评估使用相衬成像的微图案以及如前面8中所述计算平均的Brachyury（T）的强度分布为每个图案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在本文中，我们通过使用激光切割机产生1000微米的特征描述模板电池的制造。模版被由两部分组成：一薄镂花片含有通孔的微图案（大约100-200微米厚），以及将PDMS垫片以包含ECM的包衣溶液或细胞悬浮液。这里，127微米和2毫米厚的市售的PDMS片分别用作制版片和垫圈。制备可控厚度的PDMS片，例如旋涂等方法，也可用于制造的部件。两种成分通过使用液态未固化的PDMS预聚物交联剂混合物作为粘合剂或等离子体粘结粘合在一起，并且在60℃下3-4小时（ 图1）烘焙。
基于细胞培养S的选择被选定为镂花片的材料ubstrate。当使用常规的组织培养聚苯乙烯（TCPS）作为培养基质，PDMS模具可以由于PDMS镂花板的遵守被用于将形成与刚性TCPS（E〜3 GPA）（ 图2A）的良好密封。在实验设计，其中一个希望调查上较软的细胞培养基材，例如具有5千帕至2MPa 30，可以采用更硬的镂花材料的可调谐的刚度范围的弹性体的PDMS衬底 的干细胞命运的空间异质性。作为一个例子，我们证明了使用聚对苯二甲酸乙酯（PET）的模版（E〜2 GPA）的生成1毫米较软的PDMS衬底 上微图案HPSC菌落具有〜5千帕（ 图2B）的刚度。在PET模版通过胶合将PDMS垫片到由市售PET膜（图2B，插图 ）一个制版薄板制成。我们注意到，在图案化过程中所需要的细胞附着时间过程较长刚度〜5千帕的较软的PDMS衬底上（〜3小时），为相对于传统的TCPS基板。
我们使用的模具微图案人类胚胎干细胞克隆表现出细胞粘连介导的机械力能早日格局分化mesoendoderm的空间异质性。之前我们已经表明，人类胚胎干细胞H9在殖民地外围经历更高的整合比粘连细胞在殖民地内部，与活化，BMP4和FGF2 31（ 图诱发导致其优先分化成短尾（T）阳性mesoendoderm细胞。3A ）。当细胞以恒定菌落面积进行构图成不同的几何形状（圆形，正方形，矩形和半圆形的弧线），在正方形，矩形，和凸曲率导致整合素介导的牵引力的局部浓度的角几何各向异性并导致增加mesoendoderm分化32,33。事实上，通过在一个单一的集落内的不同地区的映射Ť表达强度，我们发现，mesoendoderm感应的程度明显高于在正方形和长方形菌落（ 图3B）的尖角和一个半圆弧形的凸曲率（ 图3C），这对应于报高整合素介导应力的区域中的各向异性几何32,33。因此，图案化可用于调节细胞粘着介导的机械力的一个完整HPSC菌落内的空间分布，以控制随后的分化过程的装置。
图1.生成PDMS模板的微图案的。（ 一）示意图代表模具制造的关键步骤。 A 127微米厚的PDMS片材拉丝氨酸切割以产生所设计的图案，以及另外2毫米厚的PDMS片材激光切割，以产生垫片。这两个组件用未固化的PDMS组装模板贴合在一起。（B）图像显示部件组装，形成通孔1毫米一个圆形模板PDMS。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.微模式人类胚胎干细胞集落（1000 微米圆圈）在不同的培养基材。人类胚胎干细胞微图案菌落的显微图像去除用来产生在硬基板，人类胚胎干细胞微图案（A）的PDMS模具（插图）后立即例如 ，刚性的TCPS〜 2 GPA，和（B）的PET模具（插图）用于生成软基体， 例如微图案，刚度〜5千帕的PDMS。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.对自己的mesoendoderm分化 8个 不同的几何形状的人类胚胎干细胞微图案 。（A）不同的几何形状，但使用PDMS模板生成相同的殖民地地区的人类胚胎干细胞微图案。在等距圆形菌落或不等轴正方形和长方形的殖民地后mesoendoderm分化24小时相位图像（上图）和强度图牛逼的表达（下图）的。（B）平均牛逼强度分布（沿着白虚线（A）） 。所有的殖民地有同样的面积前概念的50％圆，其具有集落面积的一半（C）从所述凹或凸的边缘成在半圆弧的菌落内的平均Ť强度分布，通过在白色虚线（A）中所指示的。在（BC）的每个强度分布是从4个集落获得的16强度分布的平均值。图像被重新印刷与桃李等权限。人 。，8。比例尺= 200微米和俄罗斯足协是相对荧光单位。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.工作流微图案的hESC集落，并诱导分化的示意图。对成功代的hESC微图案的关键步骤以灰色突出显示框。.COM /文件/ ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
微图案模板的制作
模板缩微提供生成HPSC微图案调查利基介导的分化图案的理想方法。比其他图案化技术，例如微接触印刷和光图案模版图案形成的主要优点是，它不需要表面改性，可在常规的TCPS衬底来实现。因此，对于不同的HPSC线进行了优化培养基和ECM涂料可以很容易地转移到模版图案化。
有有助于良好微图案的产生的细胞模版的制造过程中的一些关键步骤。在HPSC微图案再现所设计的几何形状的保真度取决于在制版板材的质量和通孔加工的一致性。对于涉及多micropat研究的> 1000微米燕鸥，通孔可通过在预铸的PDMS片的激光切割被直接制造。激光切割的分辨率取决于激光光束的光点尺寸和机械级控制激光束的路径的精度。对于常规的 CO 2激光切割机，我们发现它可以产生具有良好的保真度的圆形或弯曲的特征，但不与尖角几何（ 例如 ，正方形）。在小的或尖锐的特征所需的应用中，通孔在制版片可以通过在含有微图案28的浮雕微加工硅模板模制的PDMS制成。成形方法的挑战是贯通孔与在硅模板浮雕没有残余的PDMS在薄的PDMS片，以产生微尺寸。多种策略已经被开发来解决这个问题，因为由Li 等说明。人 28
在如sembly的制版片和垫片，以产生细胞模版的，应该确保该制版薄板是平的，无粉尘在接合工艺期间，为了防止从模版泄漏。在接合工艺期间的镂花板的屈曲可能危及模具的密封到培养基质，引起细胞外基质和细胞的解决方案，从微图案的通孔泄漏。模版应该通过高压（120℃，30分钟）进行消毒并在烘箱中进行彻底干燥以确保它能够形成与培养基材的良好密封。
另一个重要因素是镂花片材料的选择。将PDMS模板是理想的图案化hPSCs到刚性培养基材如TCPS与〜为2GPa的刚度。然而，如果一个人希望微图案hPSCs到较软的基质，如对通常使用的调谐电池基板刚度34，PDMS的合规性的PDMS衬底制版薄板会使其难以剥离细胞接种处理后的模版，因此破坏HPSC微图案。在这种情况下，该模具的镂花片的材料选择必须被选择成使得它能够形成与培养基材的密封，但是可以容易地剥离。
生成HPSC微图案
对于缩微H9人类胚胎干细胞使用上这里提出了PDMS模板TCPS基板的协议进行了优化，以达到良好的细胞活力和图形保真度融合的殖民地。至关重要的是，所述hPSCs形成由微图案定义，以便人们可以调查几何相关因素如何影响分化命运特定的几何形状的空间限制内适当的细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用。我们已经确定了几个关键的步骤成功生成HPSC微图案（ 图4）并且它们如下讨论。
首先，HPSC文化素质很重要。它在70-80％汇合收获HPSC菌落，与大多数菌落表示同时除去分化的区域未分化HPSC形态是很重要的。过汇合HPSC培养物通常会导致自发的分化，并且如果有区别的区域之前没有细胞接种除去，分化的细胞会打乱正常分化形成图案。
第二，收获HPSC菌落时单细胞悬浮液，从而避免过度治疗与消化酶是关键的，因为这往往即使细胞最初可以附着过夜培养后导致细胞死亡。我们发现，8分钟酶处理的最适合在我们的实验室培养的人类胚胎干细胞H9线;虽然我们建议细胞脱离治疗时间应分别针对不同细胞系进行优化。
最后，有必要以钝化包围HPSC微图案与非细胞粘附分子的衬底，以便约束增殖或微图案内分化的细胞。这是必要的，以保持HPSC微图案的保真度，进而，对于分化型态的生物化学和机械环境梯度发展。细胞培养物相容的非离子表面活性剂，例如Pluronic F-127可被用作钝化剂。当用表面活性钝化，处理时间和浓度应由于表面活性剂的细胞毒性在长曝光被优化。正如我们上面所讨论的，所提出的协议提供了详细的指引，微细图案使用PDMS模板hPSCs，但该协议，尤其是对上述关键步骤，优化鼓励苏ccessfully产生HPSC微图案。
模版微图案中的一个限制是，它更适合于产生较大的微图案包括从100-1,500微米。以产生非常小的特征旨在用于单细胞图案化，镂花板的<50微米的通孔的制造如前所述是非常具有挑战性。因此，我们预计，使用模板微图案hPSCs是非常适合进行调查期间，不同的发育过程（ 例如，神经上皮折叠或内胚层图案）多细胞组织格局的形成。
通过使用缩微以几何级数限制一个HPSC人口，我们可以建立细胞粘附介导的机械10和旁分泌信号梯度6，以控制和理解产生分化命运的空间组织。这些微图案HPSC型号，空间组织differentiation可以反过来被翻译成人体特异疾病或致畸筛选模型11先天性出生缺陷。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由新加坡国立大学（R-397-000-192-133）和ETPL峡基金（R-397-000-198-592）支持的启动资助。 GS是新加坡国立大学的研究学者。作者想感谢Jiangwa兴博士为她的细胞微技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
